Metody wykrywania alergenów w produktach spożywczych

Autorzy: dr inż. Karolina Pycia , dr inż. Joanna Kaszuba , prof. dr hab. inż. Grażyna Jaworska Data publikacji: 05.09.2024 r. Numer wydania: 3/2019

Żywność

Pierwszą z wymienionych zaczęto stosować w 1988 roku, umożliwia ona skopiowanie kilku fragmentów DNA jednocześnie. Tę metodę z powodzeniem można stosować w analizie zafałszowań żywności. Wykorzystywano ją do identyfikacji konkretnych gatunków mięsa w przetworach mięsnych czy zafałszowania mlekiem krowim serów wytwarzanych na bazie innego mleka. Z kolei metoda PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) umożliwia identyfikację nawet blisko spokrewnionych ze sobą gatunków. Z powodzeniem jest stosowana w analizie zafałszowania przetworów rybnych [9]. Odmianą klasycznej PCR jest metoda RAPD (random amplified polymorphic DNA), w której wykorzystuje się tylko jeden starter oligonukleotydowy o długości od kilku do kilkunastu nukleotydów. Starter taki umożliwia amplifikowanie obu nici DNA jednocześnie. Metoda znalazła zastosowanie do identyfikacji gatunków roślinnych i zwierzęcych w żywności. W celu zapewnienia wydajnych i niezawodnych metod identyfikacji wymienionych alergenów, opracowano oraz zwalidowano dwa nowe ilościowe multipleksowe systemy reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Jednocześnie pozwalają oznaczyć DNA w takich produktach jak: orzeszki ziemne, orzechy laskowe, seler, soja, jaja, mleko, migdały i sezam. Testy charakteryzują się dobrą specyficznością i czułością w zakresie 0,01%. Pierwsze porównania wyników ELISA z wynikami PCR sugerują jakościową zgodność, ale niską korelację wyników ilościowych [11].

Metody immunodiagnostyczne

Do grona metod immunodiagnostycznych powszechnie stosowanych w identyfikacji i analizie ilościowej antygenów należą testy ELISA. Generalnie zasada metod immunodiagnostycznych opiera się na specyficznej reakcji antygen − przeciwciało (Ag-Ab). W tym przypadku przeciwciała muszą być selektywne i wiązać białka z dużym powinowactwem, co zapewni wysoką czułość tych testów [2]. Testy ELISA używają jako markerów przeciwciał konkretnych enzymów, takich jak: peroksydaza chrzanowa, fosfataza alkaliczna, oksydaza glukozowa lub β-galaksozydaza. W praktyce stosuje się dwa rodzaje testów immunodiagnostycznych ELISA, a mianowicie test kanapkowy (sandwich) s-ELISA oraz test kompetencyjny c-ELISA [2]. Najpopularniejsze, dostępne na rynku testy immunoenzymatyczne (ELISA), oparte są na monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciałach. Pozwalają na wykrycie jednego lub więcej alergicznych białek w żywności. Właściwości wiązania przeciwciał w metodzie ELISA mogą być zmienione, gdy docelowe białko alergenne jest denaturowane lub zmodyfikowane podczas obróbki (m.in. termicznej) żywności, tym samym prowadząc do wyników fałszywie ujemnych lub zmniejszonych ilościowo [12]. Testy kanapkowe znalazły zastosowanie w detekcji alergenów: jaj, skorupiaków, sezamu lub soi. Natomiast test kompetencyjny ELISA jest użyteczny w kierunku oznaczania białek mleka, alergenów orzechów ziemnych czy migdałów [2]. Testy ELISA mają zakres czułości rzędu ~ 0,1-5 mg/kg [13]. Jednak tę właściwość można poprawić poprzez połączenie testów ELISA ze spektrometrią mas (ELISA-ICP-MS). Podręczną, bardzo szybką i wygodną w użyciu odmianą testów ELISA są paski z użyciem poprzecznego przepływu (lateral flow assays; LFA) oraz proste paski testowe. Do weryfikacji wyniku testu niezbędne są specjalne czytniki. Czułość pasków jest dosyć wysoka jak na prostotę zastosowania i wynosi 1-20 mg/kg. Do metod immunodiagnostycznych należy także metoda Western blot, która polega na analizie białek rozdzielonych w elektroforezie jednokierunkowej (SDS-PAGE) oraz w elektroforezie dwukierunkowej (2SDS-PAGE). Wykorzystywana jest do detekcji alergenów orzechów laskowych i migdałów w czekoladzie. W praktyce opisywana metoda ma wiele zalet, a do najważniejszych należy znaczna oszczędność czasu oraz pracy. Jednoczesną detekcję kilku alergenów umożliwia metoda multiplex enzyme immunoassay (EIA). Metoda ta jest pomocna w detekcji alergenów w orzechach. Technika elektroforezy jest istotą innej metody immunodiagnostycznej, a mianowicie immunoelektroforezy rakietkowej (RIE). W tej metodzie białka antygenowe migrują w żelu elektroforetycznym, a w miejscu kontaktu z przeciwciałem formują się percypity mające kształt rakiety. Stąd też pochodzi nazwa tego testu [9]. Wymienione wybrane metody immunodiagnostyczne są cenione w diagnostyce oraz w analizie żywności ze względu na niezawodność, czułość oraz dokładność.

Metody chromatograficzne

Spektrometria mas (MS) jest obiecującą alternatywą dla powszechnie stosowanych testów opartych na przeciwciałach. Powodem tego jest zdolność do ilościowego oznaczania wielu białek w złożonych matrycach o wysokiej czułości. W ostatnich latach na znaczeniu zyskała metoda LC-MS/MS, co pozwala lokować ją jako jedną z najnowszych technik analitycznych w wykrywaniu i identyfikacji alergenów pokarmowych. Metoda ta pozwala na analizę strawionego fragmentu peptydu białek alergennych, uwzględniając ich różne masy cząsteczkowe [14]. Metoda LC-MS/MS wykazuje najwyższy potencjał względem przyszłych ulepszeń, dzięki swojej niezawodności, czułości i specyficzności w stosunku do konwencjonalnych technik analitycznych. Możliwości multipleksowania są szczególnie atrakcyjne ze względu na zwiększoną złożoność i różnorodność matryc żywnościowych. Rosnąca ogólnoświatowa powszechność alergii pokarmowych motywuje do opracowania metod analitycznego postępowania skierowanego na multipleksowanie ilościowego oznaczania alergenu w przetworzonej żywności. Jeden krok w tym kierunku polega na ustanowieniu peptydów proteotypowych dla głównych białek alergennych jako markerów w oznaczeniu ilościowym alergennego białka w produktach spożywczych, w którym zastosowano wybrane monitorowanie reakcji (SRM − selected reaction monitoring) [15]. W najnowszych badaniach metoda LC-MS/MS została wykorzystana do wykrywania i identyfikacji 12 alergenów, w tym: białka jaja, odtłuszczonego mleka, orzeszków ziemnych, soi i orzechów (migdał, orzech brazylijski, nerkowiec, orzech laskowy, pekan, orzech sosnowy, pistacja) i służy do szybkich badań przesiewowych popularnych produktów spożywczych, jak chleb, ciastka i inne wyroby piekarnicze. W przeciwieństwie do testów immunologicznych, metoda przesiewowa wykrywa wiele peptydów z każdego alergennego białka, poprawiając specyficzność metody i minimalizując potencjał wyników fałszywie dodatnich i ujemnych [16].

Metody immunochromatograficzne

Immunochromatografia łączy zalety homogenicznych i heterogenicznych metod analitycznych. Łączy szybkość homogenicznego testu immunologicznego z rozdziałem reagujących i nieprzereagowanych związków różnymi heterogenicznymi metodami. Inną zaletą immunochromatografii jest to, że przepływ płynu przez nośnik (np. sorbent i membrana) umożliwia oddzielenie reagujących od nieprzereagowanych produktów bez potrzeby dodatkowych etapów wytrącania lub przemywania [17].

Obecnie stosowanie testów immunologicznych jest utrudnione, ponieważ niemożliwe jest przygotowanie przeciwciał o wystarczająco wysokiej specyficzności, aby odróżnić związki, które są strukturalnie blisko spokrewnione. Jednak obiecującą strategią jest połączenie metod chromatograficznych i immunologicznych. Związki można rozdzielić na nośniku w oparciu o ich właściwości fizyczne, a następnie poszczególne związki w każdej strefie można wykryć za pomocą analiz immunologicznych. System najbardziej podobny do tej metody to połączenie testów immunochemicznych z elektroforezą kapilarną [18].

Możliwości rozszerzenia zastosowania metod immunochromatograficznych jako narzędzi przesiewowych do badania jakości żywności, dotyczą opracowania systemów do wieloparametrowych testów immunochromatograficznych. Połączenie technologii paskowych i chipowych (tworzenie stref testowych jako mikrokropli na pasku i instrumentalna rejestracja wyników) pozwoli naukowcom na szybką i jednoczesną analizę wielu związków. Kolejna możliwość opiera się na połączeniu szybkich testów z przenośnymi urządzeniami rejestrującymi. Umożliwi to uzyskanie ilościowych wyników testów i danych procesowych w miejscach poza laboratorium [17].

Zastosowanie biosensorów

Nowoczesną technologią w analizie alergenów pokarmowych jest zastosowanie biosensorów składających się ze zintegrowanego urządzenia receptora-przetwornika, które jest w stanie dostarczyć selektywnych informacji ilościowych lub półilościowych przy użyciu elementu rozpoznawania biologicznego. Biosensory umożliwiają wykrywanie w czasie rzeczywistym związków oddziałujących z unieruchomioną cząsteczką docelową, która może być przeciwciałem wytworzonym przeciwko alergenowi lub jednoniciowej cząsteczce DNA zdolnej do hybrydyzacji z fragmentem DNA specyficznym dla alergenu. Duża szybkość, łatwość obsługi i wysoki stopień automatyzacji to atrakcyjne dla producentów żywności cechy biosensorów. Chociaż istnieje kilka zastosowań tej techniki w dziedzinie analizy żywności, do tej pory dostępnych jest tylko kilka metod stosowanych do wykrywania alergenów pokarmowych. Multipleksowanych testów opartych na GMR (giant magnetoresistive sensor), wykonywanych w podobny sposób do testów reaktywności krzyżowej, użyto do uzyskania krzywych standardowych dla każdego alergenu. Podobnie jak w testach reaktywności krzyżowej, różne czujniki na chipie GMR funkcjonalizowano za pomocą różnych przeciwciał specyficznych dla danego alergenu [19]. Układ czujnika powierzchniowego rezonansu plazmonowego SPR (ang. surface plasmon resonance) składa się z czterech matryc pomiarowych umożliwiających pomiar próbek i jednoczesne kontrolowanie zdarzeń wiązania na powierzchni czujnika. SPR oferuje kilka zalet w zakresie wykrywania bez etykiet, pomiarów w czasie rzeczywistym i lepszej czułości w porównaniu z technikami opartymi na ELISA [20].

Co niesie przyszłość…

Ze względu na potrzebę dysponowania naukowym zapleczem, tradycyjne laboratoryjne metody detekcji alergenów są na ogół niedostępne dla konsumenta. Dlatego ważne jest, aby rozwijać proste, bezpieczne i szybkie testy, które można połączyć ze smartfonami jako detektorami, co umożliwi ich dostępność dla użytkowników-konsumentów. Trwają prace nad określeniem potencjału do zmodernizowania tradycyjnych laboratoryjnych metod wykrywania alergenów pokarmowych, takich jak: test ELISA, cytometria przepływowa i powierzchniowy rezonans plazmonowy, poprzez połączenie ich ze smartfonem z system odczytu opartym na wspomnianych wcześniej właściwościach telefonu [21].

Należy zaznaczyć, iż indywidualne podejście do alergii pokarmowych staje się coraz bardziej wykonalne, ponieważ uczymy się więcej o fenotypach alergicznych i dysponujemy coraz lepszymi metodami diagnostycznych. Dostępność coraz bardziej wyspecjalizowanych produktów spożywczych umożliwia lekarzom spersonalizowane porady. Wielodyscyplinarne podejście zespołu, w tym dietetyka, ma kluczowe znaczenie w przygotowaniu indywidualnych zaleceń dla pacjentów [22].

Podsumowanie

Pomimo dużej liczby dostępnych technik i metod służących detekcji alergenów nadal prowadzone są prace nad opracowaniem nowych metod lub ulepszeniem istniejących, gdyż zawsze może być lepiej, nawet w analityce. Większa czułość, precyzja, specyficzność to tylko niektóre z właściwości metod, które zawsze można poprawić. W końcu rzecz toczy się o dobro najcenniejsze, czyli zdrowie, a nawet życie osób, które zmagają się nie z własnej winy z alergiami pokarmowymi.

Piśmiennictwo

Jędrychowski L.: Alergeny pokarmowe jako czynniki ryzyka zdrowotnego. „Żywność”, 2001, 4 (29), 62-81.
Słowianek M., Leszczyńska J.: Detekcja alergenów w żywności. Metody immunodiagnostyczne. „Przemysł Spożywczy”, 2011, 2, 65, 30-32.
Szymkiewicz A.: Alergeny pokarmowe pochodzenia roślinnego. „Przemysł Spożywczy”, 2007, 7, 35-38.
Wróblewska B.: Białka pochodzenia zwierzęcego jako alergeny pokarmowe. „Przemysł Spożywczy”, 2007, 12, 14-17.
Anandan C., Sheikh A.: European developments in labelling allergenic foods. „BMJ”, 2005, 331, 1155.
Ju S.Y., Park J.H., Kwak T.K., Kim K.E.: Attitudes and preferences of consumers toward food allergy labeling practices by diagnosis of food allergies. „Nutrition Research and Practice”, 2015, 9 (5), 517-522.
Kirsch S., Fourdrilis S., Dobson R., Scippo M.L., Maghuin-Rogister G., De Pauw E.: Quantitative methods for food allergens: a review. „Analytical and Bioanalytical Chemistry”, 2009, 395 (1), 57-67.
Sancho A.I., Mills E.N.C.: Proteomic approaches for qualitative and quantitative characterisation of food allergens. „Regulatory Toxicology and Pharmacology”, 2010, 58 (3), S42-S46.
Sawicki W.: Identyfikacja zafałszowań żywności z zastosowaniem metod PCR. „Przemysł Spożywczy”, 2009, 4, 28-31.
Mafra I., Ferreira I.M., Oliveira M.B.P.: Food authentication by PCR-based methods. „European Food Research and Technology”, 2008, 227 (3), 649-665.
Köppel R., Dvorak V., Zimmerli F., Breitenmoser A., Eugster A., Waiblinger H.U.: Two tetraplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from eight allergens in food. „European Food Research and Technology”, 2010, 230 (3), 367.
van Hengel A.J.: Food allergen detection methods and the challenge to protect food-allergic consumers. „Analytical and Bioanalytical Chemistry”, 2007, 389 (1), 111-118.
Monaci L., Visconti A.: Immunochemical and DNA-based methods in food allergen analysis and quality assurance perspectives. „Trends in Food Science & Technology”, 2010, 21 (6), 272-283.
Koeberl M., Clarke D., Lopata A.L.: Next generation of food allergen quantification using mass spectrometric systems. „Journal of Proteome Research”, 2014, 13 (8), 3499-3509.
Croote D., Quake S.R.: Food allergen detection by mass spectrometry: the role of systems biology. „NPJ Systems Biology and Applications”, 2016, 2, 16022.
New L.S., Schreiber A., Stahl-Zeng J., Liu H.F.: Simultaneous analysis of multiple allergens in food products by LC-MS/MS. „Journal of AOAC International”, 2018, 101 (1), 132-145.
Dzantiev B.B., Byzova N.A., Urusov A.E., Zherdev A.V.: Immunochromatographic methods in food analysis. „Trends in Analytical Chemistry”, 2014, 55, 81-93.
Zhang Z., Li X., Ge A., Zhang F., Sun X., Li X.: High selective and sensitive capillary electrophoresis-based electrochemical immunoassay enhanced by gold nanoparticles. „Biosensors and Bioelectronics”, 2013, 41, 452-458.
Ng E., Nadeau K.C., Wang S.X.: Giant magnetoresistive sensor array for sensitive and specific multiplexed food allergen detection. „Biosensors and Bioelectronics”, 2016, 80, 359-365.
Ashley J., Piekarska M., Segers C., Trinh L., Rodgers T., Willey R., Tothill I.E.: An SPR based sensor for allergens detection. „Biosensors and Bioelectronics”, 2017, 88, 109-113.
Ross G.M., Bremer M.G., Nielen M.W.: Consumer-friendly food allergen detection: Moving towards smartphone-based immunoassays. „Analytical and Bioanalytical Chemistry”, 2018, 410 (22), 5353-5371.
D’Auria E., Abrahams M., Zuccotti G., Venter C.: Personalized Nutrition Approach in Food Allergy: Is It Prime Time Yet. „Nutrients”, 2019, 11 (2), 359.