Badanie mikrobiologiczne wyrobów farmaceutycznych

Przyjmuje się, że liczby TAMC i TYMC odpowiadają liczbom CFU znalezionych na podłożach agarowych. Jeżeli określone jest kryterium akceptacji dla jakości mikrobiologicznej, interpretuje się je następująco:

• 10¹ cfu: maksymalna dopuszczalna liczba = 20
• 10² cfu: maksymalna dopuszczalna liczba = 200
• 10³ cfu: maksymalna dopuszczalna liczba = 2000, itd.

W przypadku analiz jakościowych proces badania wydłuża się o kolejne etapy związane z przesiewaniem badanej próbki na różne podłoża i ich okresy inkubacji. Poszukując bakterii Gram-ujemnych tolerujących żółć, czyli tych należących do rodziny Enterobacteriaceae, próbkę przygotowuje się w rozcieńczeniu 1:10, stosując jako rozcieńczalnik bulion z hydrolizatem kazeiny i soi. W ten sposób przygotowany produkt po wymieszaniu inkubuje się w temperaturze pokojowej przez okres wystarczający na ożywienie bakterii, lecz niewystarczający na rozpoczęcie procesu namnażania drobnoustrojów (2-5 h). Po tym czasie do odpowiedniej ilości bulionu Mossela dla pałeczek jelitowych dodać preparat tak, aby otrzymać kolejne rozcieńczenia produktu odpowiadające: 1 g, 0,1 g oraz 0,01 g. Po 48 h inkubacji dokonuje się posiewu powierzchniowego na podłoże agarowe z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą w celu obserwacji wzrostu bakterii Gram-ujemnych tolerujących żółć (tab. 3) [6, 7].

Jeżeli nie jest narzucone inaczej, do badania ogólnej liczby bakterii i grzybów najczęściej wykorzystuje się 10 g lub 10 ml analizowanego produktu. Po uprzednim rozcieńczeniu produktu należy przygotować po dwie szalki Petriego dla każdego rozcieńczenia i podłoża. W kierunku określenia TAMC (ogólna liczba mikroorganizmów) płytki należy inkubować przez 3-5 dni w temperaturze 30-35^oC na podłożu TSA (agar z hydrolizatem kazeiny i soi), natomiast dla TYMC (ogólna liczba drożdży i pleśni) przez 5-7 dni w temperaturze 20-25^oC na podłożu Sabouraud z dekstrozą (fot. 1).

Określając bądź wykluczając obecność innych drobnoustrojów patogennych takich jak: Escherichia coli, Staphylococcus aureus lub Pseudomonas aeruginosa należy wartość 1 g/1 ml produktu poddać inkubacji w płynnym podłożu namnażającym (bulion z hydrolizatem kazeiny i soi), a następnie po upływie 18-24 h wykonać posiewy na podłoża wybiórcze i selektywne: MacConkeya (E. coli), agar z cetrymidem (P. aeruginosa) i Baird Parkera (S. aureus). Charakterystyczny wzrost tych drobnoustrojów na przeznaczonych do ich izolacji podłożach to: różowe kolonie wraz z wyraźną różową strefą precypitacji podłoża MacConkeya; czarne, opalizujące kolonie ze strefą precypitacji w podłożu Baird-Parkera; oraz wyraźny zielony kolor kolonii na podłożu agarowym z cetrymidem z częstą zmianą zabarwienia podłoża i charakterystycznym zapachem typowym dla Psedumonas (fot. 3-5).

Produkty lecznicze roślinne zawierające substancje roślinne, z dodatkiem (lub brakiem) substancji pomocniczych, przeznaczone do przygotowania naparów, np. zioła do zaparzania posiadają dużo większe dopuszczalne limity potencjalnego zanieczyszczenia mikroorganizmami. W przypadku ogólnej liczby: TAMC kryterium stanowi 10⁷ cfu/g, natomiast dopuszcza się maksymalnie 5 x 10⁷ cfu/g. Dla TYMC kryterium stanowi 10⁵ cfu/g, natomiast analogicznie dopuszcza się 5 x 10⁵ cfu/g. W przypadku analizy jakościowej przyjmuje się kryterium akceptacji 10³ cfu/g dla E. coli oraz konieczność nieobecności w 25 g produktu Salmonella. Inaczej sytuacja prezentuje się dla wyrobów leczniczych na bazie wyciągów roślinnych, dla których metoda produkcji i obróbki prowadzi do obniżenia poziomu zanieczyszczeń biologicznych. Analizując taki rodzaj próbki, przyjmuje się kryteria akceptacji o 3 rzędy niższe niż w poprzednim przypadku, czyli TAMC – 10⁴, TYMC – 10² cfu/g [6].

Podsumowanie

Klasyczne metody mikrobiologiczne oraz biochemiczne są z reguły wystarczające i efektywne w identyfikacji drobnoustrojów odzyskiwanych w badaniach czystości mikrobiologicznej. Eliminację problemu kontaminacji wtórnej próbki zapewnia prowadzenie badań z wykorzystaniem komory klasy A z laminarnym przepływem powietrza w pomieszczeniach klasy B. Powodem zanieczyszczenia suplementów diety i leków może być często sam proces wytwarzania, ponieważ temperatura i wilgotność panująca na pewnych etapach wytwarzania sprzyja rozwojowi drobnoustrojów. Obecnie wytwórcy produktów leczniczych zobowiązani są do przestrzegania wymagań sanitarnych i odpowiednich reżimów higienicznych, które wraz z innymi wymaganiami dotyczącymi jakości, stanowią zbiór zasad określonych Dobrą Praktyką Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice – GMP). W zgodzie z tymi wytycznymi niezbędne jest monitorowanie i dokumentowanie: czystości mikrobiologicznej materiałów wyjściowych, środowiska produkcji (urządzeń, powietrza, mediów, personelu) oraz gotowego produktu leczniczego.

Piśmiennictwo

1. Reguła J., Gramza A., Stachowiak B.: Udział suplementów diety w żywieniu osób dorosłych. „Probl. Hig. Epidemiol.”, 2011.
2. Jaśkiewicz M.: Czystość mikrobiologiczna leków. „Laborant”, 7, 2014.
3. Długaszewska J., Muszyński Z.: Czystość biologiczna środowiska wytwarzania produktów leczniczych. „Mikrobiologia”, 5, 2009
4. Parnowska W.: Mikrobiologia farmaceutyczna Problemy produkcji i kontroli leków. Wyd.1”. 1998, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, s. 244.
5. Tyski S.: Sposób na czysty lek. „Przemysł farmaceutyczny”, 3, 2011.
6. Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych: Farmakopea Polska. Wydanie XI, 2017. Tom I.
7. Baj J.: Mikrobiologia, 2018, Wydawnictwo PWN.

mgr Damian Sztucki
Hasco-Lek S.A.

Czytaj także: Higiena w laboratorium mikrobiologicznym kontroli jakości w firmie farmaceutycznej