Metody wykrywania alergenów w produktach spożywczych

W jednoczesnym określaniu ilościowym i identyfikacji białek alergennych bardzo pomocny jest rozwój metod spektrometrii mas. Zatem do analizy jakościowej i ilościowej współcześnie stosuje się: metody chromatograficzne, spektrometrię mas, PCR, biosensory oraz metody immunologiczne.

TITLE: Methods of detecting allergens in food products

STRESZCZENIE: Podłożem wielu współczesnych chorób cywilizacyjnych, w tym alergii, jest obecny styl życia. Stres, ciągły pośpiech, nieustannie rosnący stopień zanieczyszczenia środowiska naturalnego, znaczny udział w codziennej diecie żywności przetworzonej to tylko niektóre z przyczyn rosnącego tempa zachorowań m.in. na alergie i nietolerancje pokarmowe. Objawy alergii pokarmowych to cały szereg reakcji, począwszy od zmian skórnych, dolegliwości ze strony układu pokarmowego, poprzez trudności w oddychaniu, skończywszy na wstrząsie anafilaktycznym. Dla osób mających zdiagnozowaną alergię pokarmową podstawową metodą „leczenia” jest unikanie żywności zawierającej alergeny. Z kolei po stronie producentów leży obowiązek rzetelnego informowania konsumentów o ich obecności lub braku.

SŁOWA KLUCZOWE: alergen, alergia pokarmowa, metody immunoenzymatyczne, test ELISA, PCR, biosensory

SUMMARY: The undertow of many contemporary diseases of affluence, including allergies, is the current lifestyle. Stress, constant rush, constantly increasing level of pollution of the natural environment, significant participation of processed food in the daily diet are just some of the causes of the growing incidence of allergy and food intolerance, among others. The symptoms of food allergies include a whole range of reactions, ranging from skin lesions, gastrointestinal complaints, breathing difficulties to anaphylactic shock. For people who have been diagnosed with food allergy the basic method of „treatment” is to avoid food containing allergens. On the other hand, food producers are obliged to inform consumers about the presence or absence of allergens.

KEYWORDS: allergen, food allergy, immunoenzymatic methods, ELISA, PCR, biosensors

Na kondycję zdrowotną człowieka ma wpływ wiele czynników endogennych i egzogennych. Prawidłowe funkcjonowanie ludzkiego organizmu zależy od: stanu naszego zdrowia, rodzaju i częstości spożywania pokarmów, czynników środowiskowych oraz wzajemnych interakcji pomiędzy wymienionymi czynnikami. W sposób bezpośredni możemy wpływać na naszą dietę, która może być źródłem niebezpiecznych dla zdrowia, a nawet życia, składników alergennych. Przez lata prowadzono badania oraz dyskutowano nad kwestią nieprawidłowych lub niepożądanych reakcji organizmu na skutek spożycia pewnych pokarmów. Zaowocowało to wprowadzeniem w 1995 roku przez Europejską Akademię Alergologii i Immunologii Klinicznej klasyfikacji niepożądanych reakcji pokarmowych. Według niej niepożądane reakcje toksyczne to wszystkie objawy (zatrucia pokarmowe) występujące u osób spożywających daną żywność, a ich nasilenie wiąże się bezpośrednio z wielkością dawki pokarmowej. Natomiast niepożądane reakcje nietoksyczne nie zależą od dawki pokarmu, a jedynie występują u osób predysponowanych, zazwyczaj genetycznie, do specyficznej reakcji na dany czynnik. Niepożądane reakcje nietoksyczne obejmują dwa mechanizmy. Pierwszym są reakcje alergenne, czyli niepożądane reakcje wskutek patogenetycznych mechanizmów immunologicznych. Z kolei drugi mechanizm koncentruje się na nietolerancjach pokarmowych, w których występowaniem objawów chorobowych sterują wrodzone albo nabyte mechanizmy nieimmunologiczne. Czynniki sprzyjające występowaniu alergii pokarmowych można podzielić na dwie osobne kategorie. Pierwsza skupia uwarunkowania genetyczne oraz anatomiczne, natomiast druga obejmuje uwarunkowania zewnątrzustrojowe, których jest znacznie więcej. W tej drugiej kategorii szczególnie istotne są: rodzaj diety (nawyki żywieniowe, podaż składników odżywczych i nieodżywczych), stopień zanieczyszczenia środowiska naturalnego, stosowanie antybiotykoterapii [1].

Sposoby leczenia alergii pokarmowych

Szacuje się, że alergie pokarmowe są czwartą kategorią chorób pod względem częstotliwości występowania. Częściej występują jedynie: schorzenia układu krwionośnego, nowotwory oraz zespół obniżonej odporności organizmu. Na alergie narażone są głównie dzieci, wśród których 4-8% boryka się z tym problemem zdrowotnym. Pomimo współczesnego rozwoju medycyny oraz nauk jej pokrewnych, nadal najprostszą, a przy tym najskuteczniejszą metodą leczenia alergii pokarmowych jest dieta eliminacyjna. Polega ona po prostu na wykluczeniu z codziennego menu składników żywności wykazujących indywidualne działanie alergenne oraz produktów wchodzących w reakcje krzyżowe z alergenami. Pomocne w leczeniu objawów alergii są także środki farmakologiczne, takie jak: preparaty antyanafilaktyczne, niezbędne w sytuacji wystąpienia wstrząsu anafilaktycznego, preparaty przeciwhistaminowe lub hormonalne, ułatwiające oddychanie poprzez rozszerzenie oskrzeli. Zdaniem specjalistów z dziedziny żywienia człowieka, zapobiegać alergiom pokarmowym oraz występowaniu uczuleń może dieta w okresie niemowlęcym. Jak dowodzą wyniki badań naukowych, mleko kobiece jest bardzo cennym, naturalnym źródłem zbawiennych dla zdrowia składników bioaktywnych. W jego składzie chemicznym, obok standardowych składników odżywczych, występują składniki modyfikujące reakcje immunologiczne, w tym immunoglobuliny wydzielnicze klasy A (sIgA). Równocześnie w mleku kobiecym występują: substancje przeciwutleniające, kwas glutaminiowy, laktoferyny oraz hormony, czyli substancje wspierające mechanizmy obronne organizmu [1].

Obowiązujące prawodawstwo w krajach Unii Europejskiej (Dyrektywa 2003/89/EC Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 10 listopada 2003 r. zmieniająca dyrektywę 2003/13/EC) nakłada na producentów żywności obowiązek rzetelnego informowania konsumentów o obecności substancji czy składników o działaniu alergennym. Z tego typu informacją można się spotkać w: stołówkach, przedszkolach, szkołach, restauracjach, czyli miejscach, gdzie serwuje się potrawy. Na liście produktów spożywczych, które odpowiadają za alergie pokarmowe, znajduje się 14 pozycji, takich jak: zboża zawierające gluten (np. pszenica, owies, jęczmień, żyto) i ich pochodne, skorupiaki oraz mięczaki i produkty na ich bazie, mleko krowie i produkty mleczarskie na jego bazie, jaja, ryby, orzechy (laskowe, włoskie, nerkowca, makadamia, pekan, pistacjowe, brazylijskie, migdały), orzechy ziemne, soja, seler zwyczajny, sezam, gorczyca i produkty pochodne, łubin oraz ditlenek siarki i siarczyny w stężeniu większym niż 10 mg/kg lub w przeliczeniu na mg/l SO₂ [2]. Duża część z nich tworzy tzw. wielką ósemkę, czyli produkty zawierające alergeny wywołujące aż 90% przypadków alergii. Analizując powyższy wykaz, nasuwa się spostrzeżenie, że za alergie pokarmowe w głównej mierze odpowiadają produkty pochodzenia roślinnego, które jednocześnie wywołują niepożądane reakcje wśród dorosłych. Natomiast dzieci najczęściej są uczulone na mleko oraz jego pochodne. Mnogość alergennych białek roślinnych skłoniła do opracowania systemu pozwalającego na ich klasyfikację. Podstawę grupowania stanowią struktura chemiczna i właściwości funkcjonalne tych białek. Na bazie tego alergenne białka roślinne podzielono na kilka grup tworzących tzw. superrodziny, zawierające co najmniej 1/3 identycznych reszt aminokwasów. Najczęściej alergie wywołują białka należące do superrodziny cupin i prolamin, a także rodziny białek systemu obronnego roślin [3]. Globuliny nasion roślin strączkowych głównie tworzą superrodzinę cupin. Do tej grupy należą także alergeny orzechów ziemnych. Najlepiej znanym i równie niebezpiecznym białkiem globulinowym jest alergen o nazwie Ara h 1 powodujący większość występujących przypadków wstrząsu anafilaktycznego. Alergen ten stanowi około 15% całkowitego białka wchodzącego w skład orzechów ziemnych. Ogromne podobieństwo w sekwencji aminokwasów z alergenem Ara h 1 występuje w przypadku alergenu nasion soczewicy Len c 1. Kolejnym źródłem alergenów roślinnych są orzechy. W orzechach laskowych występuje alergen Cor a 9, a w orzechach nerkowca − Ana a 2. Rośliną białkową zawierającą alergeny jest także soja. W jej nasionach występuje glicynia, czyli najbardziej istotny alergen sojowy. Drugą grupę alergenów roślinnych tworzą prolaminy, w ramach których wyróżnia się prolaminy zbóż, albuminy typu S2, będące zapasowymi białkami nasion, oraz zbożowe inhibitory enzymów. Do tej rodziny alergenów należą bardzo niebezpieczne dla zdrowia, a nawet życia alergeny nasion sezamu Ses i 2. Działanie alergenne wykazują także białka biorące udział w mechanizmach obronnych roślin przed stresem biotycznym i abiotycznym [3]. Równie niebezpieczne dla zdrowia są alergeny pochodzenia zwierzęcego, występujące w takich produktach jak: mleko krowie, jaja, skorupiaki, ryby, mięso ssaków oraz mięso drobiowe. W składzie chemicznym mleka krowiego obecne są kazeina oraz białka serwatkowe. Kazeina wraz ze swoimi frakcjami nazywana jest Bos d 2. Natomiast białka serwatkowe zawierają silne alergeny, takie jak β-laktoglobulina oraz α-laktoalbumina. W przypadku jaj silne działanie alergenne wykazują: owotransferyna, owomukoid, owoalbumina, lizozym oraz apowitelina [4]. Alergeny występują także w mięsie ryb, a są to przede wszystkim parwoalbuminy, które są odporne na obróbkę termiczną. Najbardziej znany alergen ryb znajduje się w mięsie dorszy i nosi nazwę Gad c 1. Do grona „wielkiej ósemki” należą skorupiaki i mięczaki, popularnie nazywane owocami morza, w których występują białka o silnym działaniu alergizującym. W krewetkach zidentyfikowano dwa alergizujące białka, którym nadano nazwę Alergen I oraz Alergen II. Co ważne obydwa są termostabilne, co czyni je bardziej niebezpiecznymi dla zdrowia. Spożycie już 1-2 krewetek przez osoby uczulone może wywołać wstrząs anafilaktyczny. Z kolei do rzadkości należą alergie na mięso oraz jego przetwory. Przy czym alergie na mięso drobiowe występują rzadziej niż na mięso ssaków. W przypadku mięsa drobiu, alergenne białka różnią się masą cząsteczkową. W badaniach wykazano, że właściwości alergizujące w mięsie kurcząt wykazują białka o masach cząsteczkowych 21, 23 oraz 50 kDa, a w mięsie indyków oznaczono silny alergen o masie cząsteczkowej rzędu 91 kDa [4].

W celu wsparcia konsumentów w nierównej walce z otaczającymi nas czynnikami alergizującymi występującymi w żywności, prawodawstwo żywnościowe Unii Europejskiej (UE) wymaga oznakowania alergennych składników żywności, które są używane jako jej składniki [5]. Nakłada również obowiązek staranności w przemyśle spożywczym w celu zmniejszenia ryzyka kontaktu z alergenami na etapie produkcji, co wiąże się z odpowiednim zarządzaniem produkcją, jej monitorowaniem oraz komunikowaniem obecności alergenów w żywności. Skuteczny system etykietowania żywności jest bardzo ważny dla ochrony zdrowia konsumentów zmagających się z alergiami pokarmowymi. Ponadto agencje rządowe powinny opracowywać dane nt. rodzajów i częstości występowania tychże alergii. Natomiast producenci żywności powinni zapewnić konsumentom jasne i dokładne etykietowanie żywności [6].

Metody wykrywania alergenów w produktach spożywczych

Na całym świecie częstość i różnorodność występowania alergii pokarmowych u ludzi corocznie rośnie, motywując do opracowywania testów, które mogą w sposób niezawodny wykrywać nawet śladowe ilości alergenów w żywności. Metody te muszą być: specyficzne, czułe, wiarygodne oraz w miarę możliwości dostępne. Alergia pokarmowa jest powodowana przez białka w ich rodzimej postaci lub w postaciach zmienionych w wyniku przetwarzania żywności. Współczesny rozwój metod analitycznych przyczynił się do tego, że obecnie do wykrywania i oznaczeń ilościowych białek alergennych w złożonych mieszaninach do dyspozycji są gotowe zestawy testów biologicznych, takich jak ELISA lub PCR. W jednoczesnym określaniu ilościowym i identyfikacji białek alergennych bardzo pomocny jest rozwój metod spektrometrii mas [7, 8]. Zatem do analizy jakościowej i ilościowej współcześnie stosuje się: metody chromatograficzne, spektrometrię mas, PCR, biosensory oraz metody immunologiczne.

Metoda PCR

Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy PCR (ang. polymerase chain reaction) pozwala wykrywać i określać ilościowo markery alergenów przez amplifikację DNA kodującego białko alergenne. Metoda ta jest wysoce specyficzna i czuła, i dlatego może być użyteczna do identyfikacji wielu alergenów. Co więcej, jest najczęściej stosowana do oceny i identyfikacji matryc DNA w produktach spożywczych [9]. Należy zaznaczyć, że wykrywa tylko DNA, a nie białko, zatem analiza PCR nie jest w stanie potwierdzić obecności lub braku białka alergizującego. Natomiast nie jest odpowiednia do oznaczania alergenów z niewielkimi ilościami DNA, takich jak białko jaja i mleko. Zatem może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych [10]. Istotą reakcji łańcuchowej (PCR) jest powielenie sekwencji DNA poprzez zachodzące w wysokiej temperaturze powtarzające się cykle syntezy DNA. Całość sterowana jest przez odporną na wysoką temperaturę polimerazę. W pierwszym etapie następuje denaturacja DNA, w wyniku czego powstają jednoniciowe cząsteczki DNA. W kolejnym etapie następuje przyłączanie starterów do matrycy DNA oraz hybrydyzacja prowadząca do otrzymania dupleksów DNA/DNA. W ostatnim etapie pod wpływem polimerazy dochodzi do wydłużania starterów, w efekcie czego sekwencja DNA zostaje skopiowana [9]. Przez lata metoda PCR doczekała się wielu odmian różniących się specyfiką oraz możliwościami aplikacyjnymi. Obecnie powszechne zastosowanie w analizie żywności mają: metoda multiplex PCR, metoda PCR-RLF oraz metoda RAPD.

Czytaj także: Kwasy halogenooctowe w wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi