Escherichia coli – patogen wszechobecny

E. coli w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym i spożywczym

Ze względu na wysokie zdolności patogenne E. coli, bakterie te stanowią fundament diagnostyki mikrobiologicznej z wielu rodzajów materiałów, w tym klinicznego, ale także przemysłowego (spożywczy, farmaceutyczny). Środki spożywcze oraz preparaty farmaceutyczne gwarantują idealne warunki wzrostowe dla wielu bakterii, ze względu na dostępność wody, elementy odżywcze (źródło węgla, aminokwasy, witaminy) oraz często przystępne wartości pH. Kwestia ta coraz częściej dotyczy także kosmetyków i środków pielęgnacyjnych o bogatym składzie. Obecność E. coli jako patogenu wszędobylskiego i zdolnego do rozwoju zarówno na powierzchni naszej skóry, jak i w układzie pokarmowym musi zostać wyeliminowana z różnego rodzaju materiałów zróżnicowanymi metodami.

Obecność niektórych drobnoustrojów w preparatach niejałowych może mieć potencjalny wpływ na obniżenie oraz zniesienie efektu leczniczego danego preparatu, a ponadto może szkodzić zdrowiu konsumenta. Z tego powodu producenci muszą zapewnić niski poziom zanieczyszczenia końcowej postaci leku przez wprowadzanie aktualnych wytycznych Dobrej Praktyki Wytwarzania na każdym etapie, od produkcji, przez magazynowanie do dystrybucji gotowego produktu. Farmakopea Polska określa podstawowe wymagania jakościowe oraz metody badania produktów leczniczych oraz surowców do celów farmaceutycznych. Spełnienie wymagań farmakopealnych zapewnia odpowiednią jakość tych produktów, która gwarantuje jakość i bezpieczeństwo ich stosowania oraz skuteczność działania [6].

Analizy jakościowe w badaniach czystości mikrobiologicznej produktów kosmetycznych i farmaceutycznych są wykonywane w celu wykrycia obecności mikroorganizmów specyficznych, czyli niepożądanych, tj. tlenowych bakterii mezofilnych lub drożdży będących patogennymi i szkodliwymi dla zdrowia człowieka, takich jak: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans. Głównym źródłem zanieczyszczeń w zakładach produkcyjnych są niedostatecznie umyte i zdezynfekowane powierzchnie i urządzenia oraz niedokładny poziom sanitarny wśród personelu mającego kontakt z otwartym produktem. Nie można oczywiście wykluczyć faktu, że niektóre rodzaje surowców niosą ze sobą naturalne ryzyko występowania zanieczyszczeń bądź są syntezowane i dostarczane przez podmioty zewnętrzne, co jedynie zwiększa możliwości kontaminacji. W przypadku surowców pochodzenia roślinnego zanieczyszczenia związane są przede wszystkim z bogatym w drobnoustroje ekosystemem, jakim jest gleba. Urodzajna ziemia zawierająca dużo substancji mineralnych i materii organicznych sprzyja rozwojowi nie tylko zwierzęt, ale przede wszystkim mniej wybrednym – bakterii i grzybów [7].

Stosując zarówno metody farmakopealne, jak i postępując według norm PN ISO, do wykrywania obecności pałeczek Escherichia coli wykorzystuje się jedno główne (podstawowe) podłoże mikrobiologiczne, służące do wstępnej identyfikacji i potwierdzenia lub wykluczenia wzrostu tego rodzaju bakterii. Jest to podłoże wybiórczo-różnicujące MacConkeya, na którym pałeczki te utworzą ciemnoróżowe kolonie z charakterystyczną ciemnoróżową obwódką dookoła kolonii [6-8].

Agar MacConkeya był pierwszym opracowanym stałym podłożem różnicowym i został wynaleziony na przełomie XIX i XX wieku przez Alfreda Theodore’a MacConkeya. Celem było opracowanie pożywki, która selekcjonowałaby pod kątem wzrostu drobnoustrojów Gram-ujemnych i hamowała wzrost drobnoustrojów Gram-dodatnich. Ostateczna formuła podłoża została zaprojektowana w celu wspierania wzrostu Shigella i jest obecnie najczęściej stosowana. Bakterie Gram-ujemne rosnące na podłożach różnią się zdolnością fermentacji laktozy cukrowej. Bakterie, które fermentują laktozę, powodują spadek pH podłoża, a wynikającą z tego zmianę pH wykrywa neutralna czerwień, która ma kolor czerwony przy pH poniżej 6,8. Gdy pH spada, neutralna czerwień jest absorbowana przez bakterie, które pojawiają się na agarze jako jasnoróżowe do czerwonych kolonie. Bakterie Gram-ujemne, które rosną na agarze MacConkeya, ale nie fermentują laktozy, wydają się bezbarwne na podłożu, a agar otaczający bakterie pozostaje stosunkowo przezroczysty [3, 7].

Niezwykle istotną substancją w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym jest woda, zarówno ta technologiczna, jak i użytkowa. Kontrola jakości wody jest istotnym elementem, nie tylko w statystycznym monitoringu środowiska, ale także w ocenie bezpieczeństwa jej konsumentów bądź użytkowników. Na ocenę zarówno ilościową, jak i jakościową stanu wód pozwalają techniki izolacji mikroorganizmów wykorzystujące ich zdolność do wzrostu na określonym podłożu. W przypadku posiewów na podłoża stałe można wykorzystać, w zależności od potrzeby, trzy metody: płytek lanych, posiewu powierzchniowego oraz filtrów membranowych.

Badanie jakości wody opiera się na jej analizie mikrobiologicznej pod kątem organizmów wskaźnikowych, czyli takich, które świadczą o konkretnym poziomie zanieczyszczenia. Jednym z głównych tego typu wskaźników jest Escherichia coli (też Enterococcus faecalis oraz Clostridium perfringens). Zanieczyszczenie wody może wyniknąć także z błędów w jej przechowywaniu lub dystrybucji. Po przeprowadzonej kontrolnej filtracji próbki wody filtr membranowy należy przenieść na podłoże chromogenne do wykrywania bakterii z grupy coli (ang. CCA – chromogenic coliform agar). Inkubacja filtrów przebiega w temperaturze 36 ± 2^oC przez 21 ± 3 h w warunkach tlenowych. Specyficzność tego podłoża polega na jednoczesnej identyfikacji E. coli oraz bakterii grupy coli ze względu na kolorymetryczne różnice pomiędzy koloniami, które tworzą, wynikające z produkcji różnych enzymów rozkładających obecne w pożywce substraty. Obecny w podłożu związek Tergitol-7 zapobiega wzrostowi mikroflorze towarzyszącej innej niż z grupy coli [6].

Bakterie należące do grupy coli, niebędące Escherichia coli, na filtrze umieszczonym na podłożu CCA wzrastają w postaci różowo-czerwonych kolonii. Jest to efekt uzyskany poprzez rozkład substratów zawartych w podłożu przez produkowany przez nie enzym β-D-galaktozydazę. Analiza wizualna w przypadku bakterii z grupy coli jest tylko pierwszym etapem w uzyskaniu rzetelnego wyniku. Drugim etapem jest potwierdzenie braku reakcji w kontakcie z oksydazą. Grupa coli charakteryzuje się brakiem zdolności do reagowania z oksydazą, więc po izolacji weryfikowanych kolonii na sączek bibułowy i nakropieniu na nich odczynnika oksydazy nie powinna zajść żadna reakcja, czyli nie nastąpi zmiana zabarwienia na niebieski. W celu potwierdzenia należy sprawdzić wszystkie lub co najmniej 10 różowych kolonii, a dodatni bądź ujemny wynik testu na oksydazę otrzymujemy w 30 s.

Gatunek Escherichia coli tworzy na podłożu CCA ciemno niebieskie, często fioletowe kolonie. Wynika to z faktu, że bakterie te produkują zarówno β-D-galaktozydazę, jak i β-D-glukuronidazę i zawarty w podłożu tryptofan stymuluje do produkcji przez nie indolu, co zwiększa wiarygodność uzyskanego wyniku. Dlatego, że są to cechy charakterystyczne tego gatunku, jednocześnie odróżniające go od innych należących do grupy coli, dalsze badania potwierdzające nie są konieczne.

Piśmiennictwo

1. Allocati N., Masulli M., Alexyev M., Di Ilio C.: Echerichia coli in Europe: An Overview. „Int J Environ Res. Public Health”, 2013.
2. Ishi S., Sadowsky M.: Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. „Microbes Environ”, 2008, 23.
3. Baldy-Chudzik K., Bok E., Mazurek J.: Znane i nowe warianty patogennych Escherichia coli jako konsekwencja plastycznego genomu. „Postępy Medycyny Doświadczalnej”, 2015, 69, 345-361.
4. Jahandeh N., Ranjbar R., Behzadi P.: Uropathogenic Escherichia coli virulence genes: invaluable approaches for designing DNA microarray probes. „Central European Journal of Urology”, 2015, 68, 452-458.
5. Kutkowska J., Michalska M., Matuszewska R.: Antygeny powierzchniowe i czynniki wirulencji E. coli O157. „Postępy Mikrobiologii”, 2015, 54, 1, 53-64.
6. PN-EN ISO 9308-1 Jakość wody. Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli.
7. PN-EN ISO 21150:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Escherichia coli.
8. Sobierska A.: Mikrobiologia w przemyśle kosmetycznym. www.biotechnologia.pl.

Damian Sztucki
PPF Hasco-Lek S.A.