Rola błonowego białka TolC w biologii bakterii

TITLE: The role of the membrane protein TolC in bacterial biology

STRESZCZENIE: Białko TolC należy do grupy białek błony zewnętrznej (ang. outer membrane protein – OMP) występujących u bakterii Gram-ujemnych. Molekuła ta uczestniczy w różnych procesach fizjologicznych drobnoustrojów, a także wchodzi w skład pomp efflux, umożliwiając usuwanie z komórek szkodliwych substancji, w tym antybiotyków. TolC współtworzy systemy wyrzutu należące do trzech klas: ABC, MFS oraz RND, a do najczęściej identyfikowanych należą pompy MacAB-TolC, AcrAB-TolC, a także AcrEF-TolC. Poznanie mechanizmu działania i być może jeszcze innych, nieznanych dotąd funkcji białka TolC może przyczynić się zarówno do eliminacji szczepów wielolekoopornych, jak i rosnącej fascynacji nad możliwościami przystosowawczymi mikroorganizmów do zmiennych warunków środowiska.

SŁOWA KLUCZOWE: TolC, pompy efflux, ABC, MFS, RND

SUMMARY: TolC protein belongs to the group of outer membrane proteins (OMP) found in Gram-negative bacteria. This molecule is involved in various physiological processes of microbes, and is also a part of efflux pumps, enabling the removal of harmful substances from the cells, including antibiotics. TolC co-creates efflux systems within three classes of transporters: ABC, MFS and RND, and the most frequently identified are MacAB-TolC, AcrAB-TolC or AcrEF-TolC pumps. Understanding the action and perhaps other, unknown functions of the TolC protein may contribute both to the elimination of multi-drug resistant strains and the growing fascination over the adaptability of microorganisms to changing environmental conditions.

KEYWORDS: TolC, efflux pumps, ABC, MFS, RND

W pracy tej została opisana aktywność transporterów błonowych, tzw. pomp efflux, w których skład wchodzi białko TolC.

Odkrycie antybiotyków stworzyło szansę ratowania ludzkości przed chorobami, często śmiertelnymi. Równolegle ze zjawiskiem powszechnego stosowania leków, drobnoustroje wykształcały, i nadal to robią, mechanizmy pozwalające im przetrwać, co jest przejawem ich niesłychanych zdolności adaptacyjnych [1]. Znane są trzy główne mechanizmy bakteryjnej oporności względem antybiotyków, do których zalicza się: inaktywację substancji przeciwdrobnoustrojowej, zmianę struktury przestrzennej cząsteczki docelowej dla antybiotyku (co uniemożliwia oddziaływanie z lekiem), a także ograniczenie wnikania szkodliwych związków np. poprzez wyrzut poza komórkę [2].

W pracy została opisana aktywność transporterów błonowych, tzw. pomp efflux, w których skład wchodzi białko TolC. Transportery błonowe Procaryota są dość dobrze poznane i w oparciu o homologię sekwencji białek, ogólną ich strukturę, a także źródło energii, zostały podzielone na pięć klas: ABC (ang. ATP-binding cassette), MFS (ang. major facilitator superfamily), MATE (ang. multidrug and toxic compounds extrusion), RND (ang. resistance-nodulation-cell division) oraz SMR (ang. small multidrug resistance) [3, 4]. Rozpatrując zróżnicowanie w budowie osłon komórkowych bakterii, można uznać, że u bakterii Gram-ujemnych występują transportery zaliczane do wszystkich klas. Do niedawna uważano, że bakterie Gram-dodatnie posiadają cztery rodzaje pomp (brak RND), jednakże w ostatnim czasie wykazano obecność genów kodujących białka typowe dla transporterów RND u szczepów Staphylococcus aureus oraz Corynebacterium glutamicum [5, 6, 7]. Każda z pięciu klas pomp różni się źródłem pozyskiwanej energii, budową oraz, co za tym idzie, zakresem preferencji do określonych substratów. Ich cechą wspólną jest wyrzut związków z udziałem transportu aktywnego. W związku z tym, iż jest to proces endoergiczny, czyli zależny od dostarczenia energii, jest on sprzężony z reakcją egzoergiczną – hydrolizą ATP w przypadku rodziny pomp ABC, co określa się pierwotnym transportem aktywnym. Pozostałe klasy transporterów wykorzystują wtórny transport aktywny, jakim jest bierny przepływ protonów H⁺ lub jonów Na⁺ [1]. Oba rodzaje transportu występują wszechobecnie u bakterii, jednakże obserwuje się korelację pomiędzy ich obecnością a sposobem wytwarzania energii u danej grupy drobnoustrojów. Przykładowo, bakterie fermentujące preferują uzyskiwać energię na drodze transportu pierwotnego, podczas gdy bakterie tlenowe zawierają więcej systemów opartych na transporcie wtórnym [8]. Bakteryjne geny, odpowiedzialne za kodowanie składników pomp efflux, zlokalizowane są w chromosomie, dzięki czemu otrzymują je komórki potomne (transfer pionowy), lub geny te mogą być przekazywane na drodze horyzontalnego transferu genów (transfer poziomy). Rozprzestrzenianie genów oporności może także zachodzić z udziałem bakteriofagów w procesie transdukcji. Przy udziale tych mechanizmów możliwe jest szybkie szerzenie się oporności wśród komórek bakteryjnych [2, 9, 10, 11].

Systemy jednoskładnikowy i trójskładnikowy

Pompy jednoskładnikowe zbudowane są z białek transporterowych umiejscowionych w błonie cytoplazmatycznej, jak np. KpnEF widoczne na ryc. 1 [1, 12]. Rycina ta obrazuje funkcjonowanie jednoskładnikowego systemu transportu leków, występującego u bakterii Gram-ujemnych.

W tym przypadku, ze względu na występowanie dodatkowej błony zewnętrznej, substrat transportowany jest do przestrzeni peryplazmatycznej. Przedstawiona pompa ma postać heterodimeru, a prawidłowo działający transporter budują dwa białka: KpnE i KpnF. Mimo braku jego współpracy z białkami peryplazmatycznymi oraz białkami zakotwiczonymi w błonie zewnętrznej, dowiedziono udział tej pompy w oporności Klebsiella pneumoniae na szereg antybiotyków takich jak: cefepim, ceftazydym, ciprofloksacyna, kolistyna, erytromycyna, polimyksyna, rafampicyna, streptomycyna i tetracyklina [12]. Pompy jednoskładnikowe notowane są u wszystkich znanych bakterii i zaliczane są do każdej z klas. Do niedawna sądzono, że rodzina RND skupia jedynie transportery trójskładnikowe, ale jak wcześniej wspomniano, wykazano obecność transporterów jednoskładnikowych [6, 11]. Ich mechanizm działania jest podobny zarówno u bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich, jednak u tych drugich substrat może być bezpośrednio przenoszony przez błonę cytoplazmatyczną oraz warstwę ściany komórkowej na zewnątrz komórki. Natomiast w przypadku bakterii Gram-ujemnych systemy jednoskładnikowe i wieloskładnikowe prawdopodobnie współpracują ze sobą. Pierwsze przenoszą substraty do przestrzeni peryplazmatycznej, skąd druga grupa ma możliwość dalszego transportu na zewnątrz komórki [12].

Omawiane w niniejszej pracy białko TolC (białko błony zewnętrznej) jest elementem trzyskładnikowego systemu wyrzutu leków charakterystycznego dla bakterii Gram-ujemnych. Co ciekawe, w tej grupie bakterii występują kompleksy białek należące do wszystkich pięciu klas, przy czym trzy z nich (ABC, MFS i RND) wykazują strukturę trójskładnikową, w której TolC stanowi integralny element [1, 14]. Taka złożona budowa umożliwia wyrzut substratów bezpośrednio do otoczenia komórki (ryc. 2), a nie do przestrzeni peryplazmatycznej, jak to jest w przypadku pomp efflux jednoskładnikowych [12].

W strukturze trójskładnikowych pomp efflux wyróżnia się białko błony wewnętrznej (ang. inner membrane protein – IMP), białkowy kanał błony zewnętrznej (ang. outer membrane protein – OMP) oraz spajające je peryplazmatyczne białko łączące (ang. membrane fusion protein – MFP) [12, 14, 15]. Rola, jaką odgrywają MFP, jest różna w zależności od systemu, w jakim się znajdują. Mają one za zadanie fizycznie zbliżyć do siebie błony wewnętrzne i zewnętrzne bądź stworzyć specjalny kanał między pozostałymi składnikami pompy, którym przemieszczane są substraty, jak np. antybiotyki β-laktamowe w przypadku systemu AcrAB-TolC lub makrolidy wyrzucane przez pompę MacAB-TolC [9, 16, 17].

Charakterystyka białka TolC

Białko TolC zaliczane jest do grupy białek błony zewnętrznej, a jego struktura powoduje, że może oddziaływać z białkami IMP. W kontekście kooperacji, znaczący jest także fakt, że samo białko TolC nie wykazuje specyficzności względem transportowanych substratów. Ta specyficzność determinowana jest przez region IMP [18]. Średnica kanału TolC jest na tyle duża (19,8 Å), że umożliwia translokację wielu związków różniących się wielkością. Do takich substancji zalicza się metale ciężkie, detergenty, antybiotyki, ale także większe cząsteczki, jak enzymy i toksyny. Ta różnorodność powoduje, że białko to może uczestniczyć w procesach związanych z opornością wielolekową oraz patogenezą bakterii Gram-ujemnych [9, 19, 20]. Ze względu na występowanie białka TolC u przedstawicieli licznych rodzajów bakterii, np. Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Vibrio, oraz na jego zdolność do interakcji z szerokim zakresem IMP, stanowi interesujący obiekt badawczy. O ważnej roli omawianego białka świadczy choćby przykład, gdzie aż siedem z dziewięciu zidentyfikowanych pomp u Salmonella sp. wymagało do prawidłowego funkcjonowania właśnie białka TolC. Badania pokazują, że usunięcie genu tolC skutkuje istotnym zwiększeniem wrażliwości szczepów na antybiotyki, względem których wcześniej wykazywały oporność. Dowiedziono również, że transportery, w których skład wchodzi białko błonowe TolC, mogą warunkować oporność na sole żółciowe znajdujące się w sokach trawiennych. Jest to niezmiernie ważna cecha pałeczek jelitowych, które pozbawione tego mechanizmu miałyby utrudnioną kolonizację dalszych odcinków przewodu pokarmowego [3, 9, 18, 21, 22, 23, 24, 32].

Czytaj także: Struktury powierzchniowe bakterii Gram-ujemnych a proces wirulencji