Zastosowanie technik sprzężonych w analizie specjacyjnej selenu w napojach roślinnych

Materiały i metody

W badaniach został wykorzystany chromatograf cieczowy 1260 Infinity II LC System, Agilent Technologies, w połączeniu z tandemowym spektrometrem mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie, Agilent 6460 Triple Quad, z zastosowaniem kolumny chromatograficznej HILIC Luna 3u, Phenomenex, USA, o wymiarach 150 mm x 2 mm x 3 µm. Faza ruchoma A: 25 mM HCOONH₄ (pH 5), B: ACN, przepływ fazy ruchomej: 0,3 mL min^-1, objętość nastrzyku: 5 µL. Próbki rozdzielano za pomocą elucji gradientowej: 80% A (4 min), 50% A (8 min), 80% A (8 min). Przed przystąpieniem do analizy związków selenu w napojach roślinnych przeprowadzono optymalizację parametrów pracy aparatu. Optymalizowanymi parametrami były napięcie fragmentora, ciśnienie rozpylacza i napięcie przyłożone do kapilary. Warunki pracy detektora przedstawiono w tab. 2.

Próbki napojów roślinnych do analizy HILIC-ESI-MS/MS przygotowano poprzez wstępne frakcjonowanie przy użyciu kolumny wykluczania (SEC), wybrane frakcje poddano liofilizacji, rozpuszczeniu w fazie ruchomej, a następnie każdą z próbek filtrowano przy użyciu filtrów strzykawkowych o wielkości porów 0,2 µm. Po optymalizacji parametrów procesu rozdzielania przystąpiono do wykonania analiz i identyfikacji związków selenu. Za pomocą powyższej metody rozdzielono pięć wybranych frakcji napojów roślinnych: sojowego, owsianego i jaglanego. Na zarejestrowanych widmach mas odszukano profile izotopowe zgodne z teoretycznym profilem izotopowym należącym do selenu.

Występowanie sygnałów zgodnych z teoretycznym profilem izotopowym selenu wskazywało na obecność jego związków w napoju sojowym i jaglanym. W celu ich identyfikacji przeprowadzono fragmentację wybranych jonów pseudomolekularnych (m/z 251 oraz m/z 443) (rys. 1).

Otrzymane jony potomne dla m/z 251 mogą sugerować obecność metyloselenocysteiny (MeSeCys) w napoju sojowym. Zidentyfikowany w trybie jonów dodatnich jon o m/z 183,9 jest charakterystyczny dla związku o wzorze sumarycznym C₄H₉NO₂Se ([M+H]⁺). Poddany fragmentacji jon posiadał jednakże m/z 251, co sugeruje przyłączenie się do MeSeCys innych cząsteczek, a mogły to być dwie cząsteczki tlenu, NH₃ i woda. Następnie po odłączeniu się od MeSeCys cząsteczki amoniaku zaobserwowano sygnał charakterystyczny dla jonu o wzorze sumarycznym C₄H₇O₂Se⁺. Kolejno po utracie wody można zaobserwować intensywny sygnał przy m/z 148,9 odpowiadający C₄H₅OSe⁺. Ostatni jon fragmentacyjny o m/z 121,5 został zidentyfikowany jako C₃H₅Se⁺. Wszystkie zaprezentowane jony wskazują na obecność metyloselenocysteiny w napoju sojowym.

W przypadku napoju jaglanego jonem pseudomolekularnym, na podstawie którego zidentyfikowano związek selenu, był jon o m/z 443 zarejestrowany w trybie jonów dodatnich. Stosunek masy do ładunku 400 jest charakterystyczny dla γ-glutamylo-selenocystationiny, zatem podobnie jak w poprzednim przypadku można stwierdzić obecność cząsteczek przyłączonych do omawianego jonu. W wyniku przeprowadzonej fragmentacji nie zaobserwowano bezpośrednio sygnału dla γ-glutamylo-selenocystationiny, gdyż jon ten fragmentował do C₈H₁₅N₂O₅Se⁺, którego sygnał widoczny jest przy m/z równym 299. Kolejno po odłączeniu się atomu węgla i atomu tlenu zauważalny jest sygnał m/z 271, który jest charakterystyczny dla jonu C₇H₁₅N₂O₄Se⁺. Dodatkowo po utracie kolejnych cząsteczek na widmie zarejestrowano sygnał m/z 182, co wskazuje na obecność jonu C₄H₈NO₂Se⁺. Istotnym sygnałem na widmie jest również występowanie jonu o m/z 130, ponieważ jest to masa charakterystyczna dla glutamylu, co zarazem potwierdza obecność γ-glutamylo-selenocystationiny w analizowanej próbce. Sygnały m/z = 400 i m/z = 299 różni fragment C₄H₇NO₂, zatem odłączenie się części C₄H₇ pomiędzy m/z = 354 i 299 może także potwierdzać występowanie identyfikowanego związku.

Wnioski

Zastosowanie technik sprzężonych, które charakteryzują się unikatową selektywnością i czułością pozwala na prowadzenie badań w wielu dziedzinach: biochemii, medycynie, badaniach rutynowych, analizie środowiskowej oraz kontroli jakości żywności i leków.

Dodatkowo techniki te pozwalają na przeprowadzenie analizy specjacyjnej, która coraz częściej umożliwia znalezienie odpowiedzi, w jakiej formie badany analit znajduje się w analizowanym materiale. Wykorzystanie techniki chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie pozwoliło na rozdzielenie oraz identyfikację związków selenu w napojach roślinnych (jaglanym i sojowym).

Piśmiennictwo

1. Gawęda E.: Selen i jego związki. „Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy”, 2014, 141-149.
2. Klecha B., Bukowska B.: Selen w organizmie człowieka- charakterystyka pierwiastka i potencjalne zastosowanie terapeutyczne. „BROMAT CHEM TOKSYKOL – XLIX”, tom 4, 2016, 818-829.
3. Navarro-Alarcon M., Cabrera-Vique C.: Selenium in food and the human body: A review. „Science of The Total Environment”, tom 400, 2008, 115-141.
4. Reilly C.: Selenium in Food and Health. Springer, New York 2006.
5. Pyrzynska K., Sentkowska A.: Liquid chromatographic analysis of selenium species in plant materials. „Trends in Analytical Chemistry”, tom 111, 128-138, 2019.
6. Rayman M.: Food-chain selenium and human health: spotlight on speciation. „British Journal of Nutrition”, tom 100, 2008, 238-253.
7. Bodnar M.: Sprawdzenie możliwości wytworzenia kandydata na materiał odniesienia na potrzeby specjacji selenu w oparciu o wzbogacone w selen kiełki roślin. Rozprawa doktorska, 2016.
8. Zou X., Shen K., Wang C., Wang J.: Molecular recognition and quantitative analysis of free and combinative selenium speciation in selenium-enriched millets using HPLC-ESI-MS/MS. „Journal of Food Composition and Analysis”, tom 106, 2022.
9. Ye M., Li J., Yu R. et al.: Selenium Speciation in Selenium-Enriched Plant Foods. „Food Analytical Methods”, tom 15, 2022, 1377-1389.
10. Fang G., Lv Q., Liu C. et al.: An ionic liquid improved HPLC-ICP-MS method for. „Analytical Methods”, tom 20, 2015.
11. Smrkolj P., Stibilj V., Kreft I., Germ N.: Selenium species in buckwheat cultivated with foliar addition of. „Analytical, Nutritional and Clinical Methods”, 2005, 675-681.
12. Smrkolj P., Germ M., Kreft I., Stibilj V.: Respiratory potential and Se compounds in pea (Pisum sativum L.) plants grown from Se-enriched seeds. „Journal of Experimental Botany”, tom 57, 2006, 3595-3600.
13. Germ M., Stibilj V.: Selenium and plants. „Acta Agriculturae Slovenica”, 2007, 65-71.
14. Ferri T., Favero G., Frasconi M.: Selenium speciation in foods: Preliminary results on potatoes. „Microchemical Journal”, 2007, 222-227.
15. Wróbel K., Wróbel K., Kannamkumarath S.S. et al.: HPLC-ICP-MS speciation of selenium in enriched onion leaves – a potential dietary source of Se-methylselenocysteine. „Food Chemistry”, 2004, 617-623.
16. Kapolna E., Shah M., Caruso J., Fodor P.: Selenium speciation studies in Se-enriched chives (Allium schoenoprasum) by HPLC-ICP-MS. „Food Chemistry”, 2007, 1398-1406.
17. Bańuelos G., Freeman J., Arroyo I.: Accumulation and speciation of selenium in biofortified vegetables grown under high boron and saline field conditions. „Food Chemistry”, 2020.
18. Michalke B.: Metallomics: analytical techniques and speciation methods. 2017.
19. Lorenc W.: Badanie specjacji pierwiastków toksycznych w próbkach żywności ciekłej i stałej technikami sprzężonymi LC/ICP-DRC-MS i ESI-MS/MS. Rozprawa doktorska, 2020.
20. Siepak J.: Analiza specjacyjna w badaniach środowiska. „Ochrona Środowiska”, tom 17, 2015.
21. Hulanicki A.: Analiza specjacyjna w badaniach środowiska naturalnego. „Przegląd Geologiczny”, tom 46, 1998, 9.
22. Zhao Y.Q., Zheng J.P, Yang M.W. et al.: Speciation analysis of selenium in rice samples by using capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry. „Talanta”, tom 84, 2011, 983-988.
23. Ulewicz-Magulska B.: Selen w roślinnych surowcach leczniczych, zawartość, rozmieszczenie i wzajemne relacje z innymi pierwiastkami. Rozprawa doktorska, 2008.
24. Karasiński J.: Scenariusz analityczny badania specjacji cynku w tkankach roślin hałdowych. Rozprawa doktorska, 2014.

Justyna Jemielita
Inga Sowik
dr inż. Joanna Zajda
dr hab. inż. Magdalena Matczuk
dr hab. inż. Lena Ruzik, prof. uczelni
Politechnika Warszawska, Wydział Chemiczny, Katedra Chemii Analitycznej