Systemy hodowli bakterii mikroaerofilnych i ściśle beztlenowych

Przedstawione w artykule systemy hodowli mikroorganizmów wrażliwych na tlen różnią się kosztem, komfortem pracy oraz dają różne możliwości w zakresie wykonywanych badań. W zależności od potrzeb laboratorium można dobrać odpowiednią metodę rozpoczynając od prostego wykorzystaniu świecy, metody Fortnera czy posiewu wgłębnego.

Title: Systems of microaerophiles and strictly anaerobic bacteria cultivation

Streszczenie: Ścisłe beztlenowe i mikroaerofilne bakterie są czynnikiem wywołującym wiele chorób. Diagnostyka tych patogenów opiera się głównie na metodach hodowlanych. Ze względu na wymagania środowiskowe, bakterie beztlenowe wymagają szczególnych warunków hodowli. Systemy zapewniające optymalne warunki dla wzrostu bakterii bardzo wrażliwych na tlen gwarantują izolację hodowli od tlenu atmosferycznego. Powstało wiele systemów do hodowli bakterii wrażliwych na tlen, które różnią się od siebie w zakresie kosztów, jakie trzeba ponieść, oraz komfortem pracy.

Słowa kluczowe: metody hodowli, mikroaerofile, anaeroby obligatoryjne, bakterie

Summary: Strictly anaerobic bacteria and microaerophiles cause many diseases. The diagnostics of these pathogenic bacteria is mainly based on cultivation methods. Due to environmental requirements, anaerobic bacteria need special cultivation conditions. Systems that ensure optimal conditions for the growth of oxigen-sensitive bacteria prevent the culture from atmospheric oxygen exposure. These systems differ in terms of cost and the comfort of work.

Keywords: cultivation methods, microaerophiles, obligate anaerobes, bacteria

Tlen stanowi około 21% składu powietrza, jednak około 3 miliardy lat temu stan ten był diametralnie odmienny. Był to okres, w którym powstawały pierwsze jednokomórkowe organizmy przeprowadzające fotosyntezę. W środowisku o niskim stężeniu tlenu prym wiodły mikroorganizmy beztlenowe (anaeroby), nieposiadające rozwiniętych systemów przeciwdziałających stresowi oksydacyjnemu. Pół miliarda lat później, w wyniku nagromadzenia się cząsteczek tlenu, nastąpiła katastrofa tlenowa (ang. Great Oxygenation Event), w wyniku której doszło do wymarcia organizmów beztlenowych [1, 2]. Stopniowy wzrost stężenia tlenu w środowisku spowodował ukierunkowanie ewolucji organizmów w stronę wykorzystywania lub tolerowania tego pierwiastka, czego manifestacją są dzisiejsze zróżnicowane relacje pomiędzy organizmami a O₂ (rys. 1).

Aeroby wykorzystują tlen jako ostatni akceptor elektronów w szlaku oddechowym, w celu wytworzenia ATP. Obligatoryjne aeroby uzależniają swój wzrost od dostępności tlenu, przykładem takich bakterii może być rodzaj Micrococcus, często izolowany z powietrza czy powierzchni skóry rąk. Fakultatywne aeroby, których dobrym przykładem są E. coli, Salmonella sp., Shigella sp. (z rodzaju Enterobacteriaceae), w przypadku braku O₂ przełączają metabolizm tlenowy na beztlenowy – przeprowadzając fermentację lub oddychając beztlenowo. Mikroaerofile takie jak Helicobacter pylori czy Campylobacter jejuni wykazują wzrost w obecności tlenu, wtedy gdy jego stężenie jest niższe niż w powietrzu atmosferycznym (około 5%), wyższe stężenie jest dla nich toksyczne. Niektóre z mikroaerofili wymagają zwiększonego stężenia CO₂, np. Hemophilus influenzae – są to kapnofile. Aerotolerantne anaeroby nie wykorzystują tlenu w metabolizmie, są oporne na jego działanie. Tlen wobec obligatoryjnych anaerobów jest toksyczny. Nawet w niskich stężeniach O₂ dochodzi do nagromadzenia się reaktywnych form tlenu, co może prowadzić do degradacji DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) czy uszkodzenia enzymów, a w konsekwencji do destabilizacji i śmierci komórki [3-5].

Mikroorganizmy wrażliwe na tlen są czynnikami etiologicznymi wielu chorób, często o wysokim współczynniku śmiertelności [6]. Powszechnie stosowanymi metodami diagnostycznymi, mającymi na celu zidentyfikowanie czynnika wywołującego chorobę, są metody hodowlane (tab. 1). Hodowla bakterii in vitro zakłada przeniesienie najbardziej optymalnego środowiska wzrostu mikroorganizmu do warunków laboratoryjnych. W przypadku patogenów wrażliwych na tlen należy odizolować komórki od atmosfery bogatej w O₂, zmniejszając potencjał oksydoredukcyjny do odpowiednio niskiego poziomu [7]. Istnieje wiele systemów umożliwiających wzrost mikroaerofili i ścisłych beztlenowców. Aby utrzymać odpowiednią atmosferę, w zależności od potrzeb laboratorium, stosuje się uniemożliwiające dyfuzje gazów woreczki, anaerostaty lub komory beztlenowe (fot. 1). Ważną częścią każdego z systemów jest weryfikacja niskiego potencjału oksydoredukcyjnego środowiska (jest to zdolność układu do przyjmowania lub oddawania elektronów), a co wiąże się z niską zawartością tlenu. Często w tym celu używa się błękitu metylenowego, który w środowisku redukującym (niskim potencjale oksydoredukcyjnym) odbarwia się, informując w ten sposób o uzyskaniu atmosfery beztlenowej [7-11].

Hodowle w woreczkach

Systemy woreczkowe umożliwiają wytworzenie beztlenowej lub mikroaerofilnej atmosfery przy pomocy tzw. Gas-paków (tab. 1). W 1965 r. Brewer i Allgeier stworzyli jednorazową kopertę wytwarzającą wodór, dzięki zastosowaniu bromowodorku sodu i jego reakcji z wodą. Powstały wodór, w obecności katalizatora palladowego, reaguje z tlenem obecnym w przestrzeni pojemnika w czego efekcie powstaje woda. Metodę z biegiem lat udoskonalano tak, aby wzbogacić atmosferę w CO₂ (dodanie nieorganicznych węglanów) i uniezależnić reakcje od katalizatora czy aktywacji wodą [3, 10]. Gas-paki w zależności od producenta i dedykowanych mikroorganizmów (ściśle beztlenowych, mikroaerofilnych) mogą zawierać różny ilościowo skład. Mniej skuteczną metodą wykorzystującą plastikowe worki jest metoda Fortnera, która umożliwia kultywacje anaerobów i mikroaerofili w słabo wyposażonym laboratorium. Metoda Fortnera zakłada posiew interesujących nas bakterii, wraz z organizmami tlenowymi na przykład Bacillus subtilis czy wspomnianego już Micrococcus luteus. W metodzie wykorzystuje się metabiozę (następstwo gatunków), innymi słowy jeden gatunek zmienia środowisko w taki sposób, że drugi może wykazywać wzrost kosztem braku wzrostu pierwszego [13]. W tym przypadku aerob ma za zadanie zużycie dostępnego w przestrzeni pojemnika tlenu, obniżając potencjał oksydoredukcyjny otoczenia. Proces ten umożliwia wzrost organizmu beztlenowego kosztem możliwości rozwoju ścisłego tlenowca.

Hodowla z wykorzystaniem anaerostatu

Anaerostaty to urządzenia składające się z wieczka i pojemnika. Wieczko zapatrzone jest w zawory, dzięki którym w kontrolowany sposób możliwa jest wymiana gazów, i barometru, który monitoruje ciśnienie wewnątrz szczelnie zamkniętego pojemnika. Atmosferę o odpowiednim składzie można uzyskiwać metodami opisanymi przy wykorzystaniu woreczków, tj. Gas-paków, metodą Fortnera, ale również przy pomocą butli gazowych czy prostej metody z zastosowaniem świecy. Uzyskując odpowiednią atmosferę przy pomocy butli z gotową mieszanką gazów, np. 10% CO₂, 5% O₂, 85% N₂ (warunki mikroaerofilne), należy najpierw wypompować obecny w szczelnie zamkniętym anaerostacie gaz, a następnie wtłoczyć mieszankę. Proces należy powtórzyć 2-3 razy, by wyeliminować jak najwięcej cząsteczek tlenu. Na rynku dostępne są również urządzenia, które automatyzują, monitorują i dostosowują liczbę cykli potrzebnych do ustanowienia atmosfery. Przykładem takiego urządzenia jest anaxomat. Wykorzystanie butli gazowej zwiększa powtarzalność wyników, uniezależnia proces tworzenia środowiska gazowego od reakcji chemicznych, ale wymaga większego nakładu finansowego w porównaniu do metod biologicznych czy klasycznej metody świecowej. Podczas spalania świecy w układzie zamkniętym następuje stopniowe obniżanie się potencjału oksydoredukcyjnego, aż do bardzo niskiego poziomu, odpowiedniego dla organizmów wrażliwych na tlen. Spalanie świecy, w porównaniu do wtłaczania gotowej mieszanki gazowej, dłużej wytwarza odpowiednią atmosferę, co może przyczynić się do śmierci obligatoryjnych anaerobów [3]. Interesującym sposobem na zoptymalizowanie metody jest zastosowanie wełny żelaza, która została uprzednio potraktowana zakwaszonym siarczanem miedzi. Tak spreparowana wełna żelaza absorbuje tlen, obniżając jego stężenie synergistycznie z procesem spalania, umożliwiając szybsze otrzymanie niskiego potencjału oksydoredukcyjnego. W badaniu porównującym wzrost siedmiu gatunków kontrolnych o znaczeniu klinicznym z zastosowaniem zmodyfikowanej metody świecowej i systemu wykorzystującego anaxomat, wykazano różnicę we wzroście tylko jednego gatunku. Pozostałe gatunki wykazywały porównywalny wzrost w obu metodach [8]. Zmodyfikowana metoda świecowa jest tania, łatwa w przygotowaniu i wydajna, dlatego może być stosowana w mniej wyposażonych laboratoriach czy w celach dydaktycznych.

Hodowle wgłębne

Hodowle obligatoryjnych anaerobów i mikroaerofili można wykonywać również w pożywkach płynnych o wysokim słupie cieczy lub stałych przy pomocy posiewu wgłębnego. Wraz ze wzrostem głębokości zmniejsza się stężenie rozpuszczonego tlenu. Zagotowanie płynnego medium pozwala na odgazowanie pożywki, którą następnie zalewa się warstwą parafiny, która zapobiega ponownemu napowietrzeniu. Do podłoży namnażających ścisłe beztlenowce dodaje się czynniki absorbujące tlen, takie jak pirogallol, podsiarczyn sodowy, chlorek miedziowy, a także związki obniżające potencjał oksydoredukcyjny, w tym kwas askorbinowy, cysteinę, siarczyn sodowy. Przykładem takiego podłoża jest VL z chlorowodorkiem cysteiny, które umożliwia badanie, jakie źródła węgla wykorzystuje patogen [3]. W kierunku beztlenowców bada się materiały pochodzące z jam ciała pozbawionych naturalnej flory bakteryjnej, dlatego też hodowle wgłębne umożliwiają w prosty sposób namnożenie potencjalnego czynnika chorobotwórczego, bez dodatkowej aparatur. Wynik jakościowy pozwala stwierdzić z wysokim prawdopodobieństwem, że namnożony patogen jest czynnikiem wywołującym chorobę [14].

Komora beztlenowa

W opisanych wcześniej systemach mikroorganizmy czasowo wystawione są na działanie powietrza atmosferycznego. Inokulacja, a następnie odczyt wyników, odbywa się w środowisku tlenowym. Jeżeli interesuje nas sprawdzenie wyłącznie obecności danego patogenu w próbie badanej, wcześniej opisane metody mogą być wystarczające. Jednakże przy bardziej skomplikowanych, długotrwających badaniach ważne jest zapewnienie stałej atmosfery gazowej. W zależności od badanego organizmu, nawet krótkie wystawienie na tlen może skutkować fałszywym wynikiem badania. Komory beztlenowe (fot. 1) są najbardziej kosztownym rozwiązaniem powyższego problemu. Komora utrzymuje permanentnie beztlenową lub mikroaerofilną atmosferę umożliwiając posiew i hodowle wewnątrz urządzenia (inkubatory, statywy). Utworzenie i utrzymanie odpowiedniego środowiska opiera się na systemie czujników stężenia i ciśnienia gazów, śluz, pomp, butli gazowych i szczelnie przylegających do ciała rękawic (lub mankietów), umożliwiających prace manualną [15]. Mimo wysokich kosztów zastosowanie takiej metody są badania, przy których wykorzystanie komór jest niezbędne, aby badać biologię molekularną patogenu (np. znalezienie potencjalnego celu dla leków) czy reakcje mikroorganizmu na substancje lecznicze.

Podsumowanie

Przedstawione systemy hodowli mikroorganizmów wrażliwych na tlen różnią się kosztem, komfortem pracy oraz dają różne możliwości w zakresie wykonywanych badań (tab. 1).

W zależności od potrzeb laboratorium można dobrać odpowiednią metodę, rozpoczynając od prostego wykorzystaniu świecy, metody Fortnera czy posiewu wgłębnego. Bardziej złożone, komercyjne sposoby kultywacji ścisłych anaerobów i mikroaerofili, takie jak Gas-paki, umożliwiają szybkie i łatwe utworzenie środowiska gazowego. Profesjonalne komory beztlenowe zapewniają pełną kontrolę nad warunkami wzrostu bakterii, pozwalając uniezależnić badania od dodatkowych zmiennych.

Piśmiennictwo

1. Och L.M., Shields-Zhou G.A.: The neoproterozoic oxygenation event: Environmental perturbations and biogeochemical cycling. „Earth-Science Rev”, 2012, 110, 26-57.
2. Planavsky N.J., Asael D., Hofmann A. et al.: Evidence for oxygenic photosynthesis half a billion years before the Great Oxidation Event. „Nat Geosci”, 2014, 7, 283-286.
3. Różalski A.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej: skrypt dla studentów biologii. Cz. 1, teoretyczna, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, 2004.
4. Baj J., Markiewicz Z.: Biologia molekularna bakterii. 2015.
5. Cray C., Zaias J.: Laboratory procedures. „Veterinary Clinics of North America – Exotic Animal Practice”, 2004.
6. Lee D.G.: Clinical significance of anaerobic infections. „Korean J Intern Med.”, 2009, 24, 11-12.
7. Mauerhofer L.M., Pappenreiter P., Paulik C. et al.: Methods for quantification of growth and productivity in anaerobic microbiology and biotechnology. „Folia Microbiologica”, 2018.
8. Saha U.S., Misra R., Tiwari D., Prasad K.N.: A cost-effective anaerobic culture method & its comparison with a standard method. „Indian J Med Res”, 2016, 144, 611-613.
9. Doan N., Contreras A., Flynn J., Morrison J., Slots J.: Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. „J Clin Microbiol”, 1999, 37, 171-174.
10. Brewer J.H., Allgeier D.L.: Safe Self-contained Carbon Dioxide-Hydrogen Anaerobic System. „Appl Microbiol”, 1966, 14, 985-8.
11. Behbehani M.J., Jordan H.V., Santoro D.L.: Simple and convenient method for culturing anaerobic bacteria. „Appl Environ Microbiol”, 1982, 43, 255-256.
12. Cultivation of Aerobic and Anaerobic Bacteria. www.microbeonline.com.
13. Karmali M.A., Fleming P.C.: Application of the Fortner principle to isolation of Campylobacter from stools. „J Clin Microbiol”, 1979, 10, 245-247.
14. Szewczyk E.: Diagnostyka bakteriologiczna. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013.
15. Vinyl Anaerobic Airlock Chamber Instruction Manual. Coy Laboratory Products, 2017.
16. Anaerobic Chambers – Anaerobe Systems. www.anaerobesystems.com/products/anaerobic-chambers.

Fabian Pikuła
dr Magdalena Cal
Zakład Genetyki, Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski

Czytaj także: Bakterie lubiące zimno i chłód – jak je izolować, hodować i identyfikować