Rozwój technologiczny w laboratorium mikrobiologicznym

MALDI-Tof

Spektrometria mas to technika analityczna zaliczana do metod spektroskopowych, której bazę stanowi pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego analizowanego jonu. Metodę tę wykorzystuje się między innymi do: identyfikacji i oznaczania ilości poszczególnych składników w mieszaninach organicznych, badaniach kinetyki i termodynamiki reakcji chemicznych, przeprowadzania ultraczułych wielopierwiastkowych analiz nieorganicznych, identyfikacji struktury cząstek. Wykorzystywana jest przez chemików, fizyków, kryminologów, astronomów, biochemików w medycynie, jak również w ochronie środowiska oraz wielu innych dziedzinach nauki, w tym mikrobiologii i biologii molekularnej [6].

Niezależnie od konstrukcji, przeznaczenia i funkcjonalności we wszystkich spektrometrach mas (w tym MALDI) występują trzy stałe elementy: jonizator, analizator i detektor. Jonizator to urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych, na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Tak więc jest to element odpowiadający za dostarczanie niezbędnych do przeprowadzenia analizy jonów. Analizator to miejsce, w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku. Ostatnim elementem jest detektor, czyli urządzenie zliczające jony napływające z analizatora. Zamienia on w sposób ilościowy sygnał w postaci prądu jonowego na sygnał elektryczny, który jest rejestrowany przez komputer w postaci widma stosunku masy do ładunku elektrycznego, nazywanego często widmem masowym [6, 7].

W praktyce w metodzie MALDI analizowaną próbkę miesza się z matrycą, będącą roztworem organicznym o działaniu silnie absorbującym promieniowanie lasera. Po odparowaniu takiego rozpuszczalnika próbka poddawana jest jonizacji, co powoduje wzbudzenie elektronów w matrycy, a następnie utworzone jony ulegają desorpcji. Kolejno próbka wprowadzana jest do analizatora a jony są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar ten jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów wydłuża się ich czas przelotu. Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami oraz dosyć dużą czułością [7-9].

Dzięki w pełni skomputeryzowanemu systemowi można wygenerować widmo masowe analizowanego izolatu, które stanowi swojego rodzaju odcisk palca unikatowy dla każdego gatunku drobnoustroju. W sposób w pełni automatyczny widmo jest analizowane i porównywane z szeroką bazą danych i na tej podstawie kategoryzowane jako dany gatunek mikroorganizmu (schemat 1). Prawdopodobieństwo poprawnej identyfikacji drobnoustroju w systemie wyrażane jest w postaci tzw. wskaźnika punktowego mieszczącego się w zakresie od 0 do 3000, określającego stopień podobieństwa do widm referencyjnych (tab. 1).

W 2015 roku jeden z producentów systemu MALDI-TOF MS zaproponował metodę szybkiej identyfikacji drobnoustrojów bezpośrednio w pozytywnych próbkach krwi na posiew. Wynik identyfikacji tą techniką uzyskiwany jest już po kilkudziesięciu minutach, dzięki czemu czas wdrożenia odpowiedniej i skutecznej antybiotykoterapii w przypadku sepsy jest znacznie skrócony, a szansa na szybki powrót do zdrowia pacjenta wzrasta. Poprawność wyników identyfikacji otrzymanych tą metodą jest bardzo wysoka i na podstawie licznych danych literaturowych wynosi od 63% do nawet > 90%. Niektórzy badacze zwracają uwagę na stosunkowo większy odsetek identyfikacji tą techniką bakterii Gram-ujemnych niż Gram-dodatnich [6-8].

Od czasu jonizacji desorpcji laserowej wspomaganej matrycą spektrometria masowa w czasie przelotu MALDI-TOF MS w dużej mierze zastąpiła identyfikację biochemiczną i nadal jest bezkonkurencyjna pod względem krótkiego czasu do uzyskania wyniku, niskiego kosztu oznaczania i wszechstronności oraz liczby możliwych do zidentyfikowania gatunków przy jednym przepływie pracy.

Mikroskopia

Sztandarowym elementem wyposażenia laboratorium mikrobiologicznego jest mikroskop, najczęściej optyczny. Dzięki niemu można poznać kształty mikroorganizmów, tworzone przez nie charakterystyczne układy komórek, ich liczebność w danym środowisku, a także pewne elementy strukturalne. Oprócz znanego mikroskopu złożonego mikrobiolodzy używają innych rodzajów mikroskopów, które umożliwiają oglądanie obiektów niewidocznych w mikroskopie świetlnym. Alternatywnym mikroskopem jest mikroskop ciemnego pola, który służy do obserwacji żywych krętków, na przykład wywołujących kiłę, lub mikroskop z kontrastem fazowym. Ten mikroskop zawiera również specjalne kondensatory, które wyrzucają światło „przesunięte w fazie” i powodują jego przechodzenie przez obiekt z różnymi prędkościami [10].

Najbardziej zaawansowana mikroskopia elektronowa to technika wykorzystująca wiązkę przyspieszonych elektronów do oświetlania i uwidaczniania obrazów próbek. Używając mikroskopii elektronowej, można osiągnąć znacznie większe poziomy powiększenia oraz rozdzielczość w porównaniu do standardowego mikroskopu świetlnego, ponieważ długość fali elektronów jest znacznie krótsza niż fotonów. Za pomocą tego instrumentu można zobaczyć wirusy i niektóre większe molekuły. Mikroskop elektronowy ma wiele różnorodnych zastosowań w nauce i technologii. Wykorzystywano go do badania patogenów, takich jak wirusy i bakterie, i jest szczególnie cenny w badaniu pojawiających się chorób wykorzystywanych w bioterroryzmie. Ponadto w kryminalistyce technika ta jest wykorzystywana na przykład do analizy włókien odzieży oraz pozostałości krwi i postrzału.

Wartym wyróżnienia przyrządem we współczesnej diagnostyce może okazać się mikroskop konfokalny, wykorzystujący barwniki fluorescencyjne. Mikroskopia konfokalna jest modyfikacją mikroskopii świetlnej. W porównaniu z tradycyjną mikroskopią optyczną cechuje się: zwiększonym kontrastem, większą głębią ostrości oraz zdolnością rozdzielczą. Padające światło odbija od powierzchni preparatu (lub fluoryzuje w przypadku mikroskopu fluoroscencyjnego), po czym sygnały te są zbierane przez obiektyw [10].

Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna polega na detekcji wypromieniowanego światła zaabsorbowanego uprzednio przez badany materiał. Emitowane światło w stosunku do światła absorbowanego charakteryzuje się większą długością fali. Obrazowanie opiera się na pomiarze fluorescencji związków chemicznych powiązanych z określonymi typami komórek wraz ze strukturami wewnątrzkomórkowymi lub grupami chemicznymi. W tym celu stosowane są liczne metody barwienia tzw. barwnikami fluoroscencyjnymi. Konstrukcja przesłony w detektorze umożliwia użycie w powstawaniu obrazu tylko fluorescencji emitowanej z miejsca ogniskowania.

Podsumowanie

Jeszcze jednym ciekawym i szybkim rozwiązaniem we współczesnej diagnostyce wydają się w pełni zautomatyzowane systemy, które oszczędzają czas personelu i dokonują selekcji pomiędzy próbkami pozytywnymi i negatywnymi, weryfikując pewne cechy, najczęściej biochemiczne. Najlepszym przykładem takiego rozwiązania jest system analizy próbek krwi oparty na kolorymetrii. Na dnie specjalnej butelki do poboru krwi znajduje się swojego rodzaju podłoże, które pod wpływem zmian pH spowodowanych wytwarzaniem dwutlenku węgla przez namnażające się drobnoustroje zmienia barwę. Cały proces zachodzi podczas inkubacji w specjalnych komorach służących za analog inkubatora w standardowej praktyce mikrobiologicznej. Jak na w pełni skomputeryzowany system przystało, w parze z komorą idzie oprogramowanie, które sygnalizuje o zakończeniu inkubacji oraz wygenerowanym wyniku pozwalającym na szybkie określenie próbki jako negatywnej bądź na reakcję i dokładne przebadanie jej zawartości w przypadku zmiany składu biochemicznego.

Dynamiczny rozwój technologiczny, a szczególnie popularyzacja w pełni automatycznych rozwiązań w życiu codziennym zmusza do tego, aby takie rozwiązania wprowadzać także w naszej codziennej pracy. Gdyby chcieć zwizualizować na wykresie postęp mikrobiologicznych systemów automatyki laboratoryjnej, przedstawiałby on wzrost wykładniczy z krzywą pnącą się ku górze. Choćby najmniejsze usprawnienia w codziennej pracy wpływają na jakość i komfort przeprowadzania pewnych operacji, poczynając od tak prowizorycznych przyrządów jak automatyczne pipety czy mikroskopy, po te bardziej zaawansowane, zapewniające równie dokładne co szybkie efekty – PCR, MALDI.

Piśmiennictwo

1. Marczewska J., Mysłowska K.: Szczepy odniesienia – nadzór nad szczepami. „LAB”, 2014, 1.
2. Metody przechowywania drobnoustrojów. Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2015/16.
3. Mysłowska K., Bucała-Śladowska K.: Przygotowanie mianowanych zawiesin szczepów wzorcowych znajdujących zastosowanie w badaniach mikrobiologicznych. „LAB”, 2016, 3.
4. Nowaczyk P., Merlak D.: Zarządzanie szczepami testowymi w laboratorium mikrobiologicznym badającym kosmetyki. „Świat Przemysłu Kosmetycznego”, 2013.
5. Żabicka D.: Nowoczesne metody wykrywania i identyfikacji bakterii. Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie, 2013.
6. Cieślik J., Wróblewska M.: MALDI TOF MS – nowe możliwości w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. „Diagn. Lab.”, 2018, 54, 99-104.
7. Burckhardt I.: Laboratory Automation in Clinical Microbiology. „Bioengineering”, 2018.
8. Azarko J., Wend U.: Identyfikacja drobnoustrojów – porównanie metody biochemicznej i spektometrii masowej. „Diagn Lab.”, 2011, 47(4), 409-417.
9. Kosikowska U., Pyśniak D., Ożga P.: Zastosowanie spektrometrii masowej MALDI-TOF MS w identyfikacji bakterii izolowanych z materiałów klinicznych od ludzi i zwierząt. „Diagn. Lab.”, 2015, 51, 23-30.
10. Snopinśki P., Jarka P., Bilewicz M.: Mikroskopia świetlna i konfokalna. „LAB”, 2017, 6.

Damian Sztucki
PPF Hasco-Lek S.A.