Rola błonowego białka TolC w biologii bakterii

Białko TolC zwykle bada się w kontekście oporności bakterii na szkodliwe względem nich substancje. Jednak jest ono także (a może przede wszystkim) zaangażowane w szereg funkcji związanych z fizjologią bakterii Gram-ujemnych. Zespół Raspoeta w 2019 roku wykazał, że kanał ten odgrywa ważną rolę w przeżywaniu bakterii w warunkach niedoboru żelaza. Badania te, z wykorzystaniem szczepów Salmonella Enteritidis tłumaczą dokładny mechanizm tego zjawiska. Szczepy dzikie, w przeciwieństwie do mutantów nieposiadających funkcjonalnego białka TolC, były w stanie namnażać się w białku jaj kurzych, czyli środowisku ubogim w wolne jony żelaza. Wykazano, że pompy posiadające w swojej budowie białko TolC są zaangażowane w eksport sideroforów poza komórki bakteryjne, co umożliwia ich dalszy wzrost. Badania sugerują, że wyrzut antybiotyków przez pompy efflux może zachodzić „przy okazji” przeprowadzania przez bakterie innych fizjologicznych procesów [25].

Okazuje się również, że TolC może być zaangażowane w proces formowania biofilmu bakteryjnego. Potwierdziły to badania z użyciem dzikich szczepów E. coli i ich mutantów defektywnych pod względem TolC. W warunkach charakteryzujących się wysoką osmolarnością (uzyskaną przez dodatek NaCl i sacharozy) tylko szczepy posiadające funkcjonalny gen tolC zdolne były do produkcji fimbrii typu curli. Fimbrie te odpowiedzialne są w dużej mierze za proces adhezji komórek do podłoża, co jest pierwszym i kluczowym etapem formowania biofilmu. Jednak nie zaobserwowano różnicy w tworzeniu biofilmu na podłożach o niskiej osmolarności. Wskazuje to, że białko TolC odgrywa rolę w przystosowywaniu się bakterii do różnych warunków osmotycznych otoczenia. Uważa się to za istotną cechę, ponieważ większość najgroźniejszych dla ludzi zakażeń powodowanych jest przez bakterie, które uformowały biofilm, a nie, jak kiedyś sądzono, przez formy planktoniczne. Podobnie jak u wcześniej wspomnianej bakterii K. pneumoniae, inaktywacja genu tolC u szczepu E. coli powodowała wzrost wrażliwości wobec szeregu powszechnie wykorzystywanych antybiotyków i chemioterapeutyków, takich jak: amikacyna, erytromycyna, florfenikol, norfloksacyna, chloramfenikol, tetracyklina, cyprofloksacyna, a także względem detergentu SDS [26].

Struktura białka TolC

Na podstawie badań z wykorzystaniem różnych technik, w tym mikroskopii elektronowej oraz spektrometrii mas, określono strukturę oraz masę cząsteczkową białka TolC, która wynosi około 54 kDa [14]. Proteina ta określana jest jako homotrimer, ponieważ trzy protomery utworzone z 428 reszt aminokwasowych tworzą funkcjonalne białko TolC – kanał zdolny do przenoszenia leków oraz polipeptydowych toksyn. Dodatkowo, obrazowanie z wykorzystaniem krystalografii rentgenowskiej, przeprowadzone przez zespół Koronakisa umożliwiło poznanie struktury przestrzennej białka TolC [20]. Analiza ta ujawniła cylindryczną strukturę molekularną, w której można wyróżnić dwie domeny: membranową i peryplazmatyczną. Jak nazwa sugeruje, pierwsza z nich zakotwiczona jest w błonie zewnętrznej osłon bakteryjnych. Utworzona jest z 12 nici formujących β-baryłkę, przechodzącą przez całą grubość błony [4, 20]. Oszacowano, że domena ta ma długość około 40 Å (10^-10 metra). Z kolei druga, peryplazmatyczna domena, zbudowana jest również z dwunastu α-helis, które budują kanał mający 100 Å długości i 19,8 Å średnicy prawie na całym odcinku [19, 20]. Dodatkowo w połowie tego tunelu można wyróżnić tzw. domenę równikową (ang. equatorial domain). Domena ta jest utworzona z reszt aminokwasowych o mieszanej α/β strukturze, otaczających kanał peryplazmatyczny, przez co tworzy charakterystyczne wybrzuszenie na jego powierzchni [20]. Ruch α-helis może powodować otwieranie zwężającej się części tunelu [8, 27]. Jako że przeciętna średnica światła kanału białka TolC wynosi 19,8 Å, umożliwia to transport cząsteczek mających wielkość nawet 160 kDa, czyli trzy razy większą niż masa samego białka [18, 19]. Helisy wchodzące w skład białka leżą ściśle obok siebie, jedna obok drugiej, dzięki czemu zazębiają się ich łańcuchy boczne, co stabilizuje całą cząsteczkę. Natomiast w dolnej części struktury, jaką jest kanał peryplazmatyczny, sąsiadujące α-helisy nachodzą na siebie, co tworzy sześć regularnych, dwuniciowych tzw. zwiniętych spirali (ang. coiled coil) połączonych ze sobą wiązaniami wodorowymi [19]. Trzy dwuniciowe spirale zaginają się, co skutkuje ich skierowaniem w stronę środka kanału białka TolC. To z kolei powoduje jego zamknięcie. W wyniku takiego mechanizmu światło tunelu zwęża się, pozostawiając jedynie otwór wielkości 3,9 Å, co jest zdecydowanie zbyt małym otworem na transport jakichkolwiek substratów. Z tego powodu określa się ten koniec tunelu zamkniętym [19]. Z kolei takiego mechanizmu nie obserwuje się na przeciwległym końcu tunelu białka TolC, więc jest on stale otwarty. Poza kontrolą transportu substratów pomp, konformacja zamknięta ma jeszcze jedną korzyść. Mianowicie jest ona bardzo stabilna, a jej utrzymanie nie wymaga dużych nakładów energetycznych [16, 20]. Dopiero otworzenie kanału wiąże się z wydatkiem energetycznym, co jednak jest kompensowane korzyściami wynikającymi z wyrzutu szkodliwych substancji.

Transportery ABC

Jak już wcześniej opisano, białko TolC wraz z innymi składnikami błon ma zdolność do współtworzenia pomp efflux zaliczanych do trzech klas: RND, ABC oraz MFS. Pomimo różnorodności białek należących do tej superrodziny ABC, można wyróżnić w nich kilka wspólnych cech charakterystycznych [27]. Transportery te składają się z czterech podjednostek: dwóch konserwatywnych, hydrofilowych domen wiążących nukleotydy (ang. nucleotide binding domains – NBD) oraz dwóch domen transbłonowych (ang. transmembrane domains – TMD). W skład każdej podjednostki TMD, czyli struktury złożonej głównie z niepolarnych reszt aminokwasowych, która przechodzi w poprzek błony raz lub kilkakrotnie, wchodzi po sześć transbłonowych hydrofobowych helis α. Ich zadaniem jest utworzenie kanału biegnącego przez błonę, którym będą transportowane substraty pompy. Z kolei domeny NBD (wiążące nukleotydy) określane są również jako kaseta wiążąca ATP. Jak sama nazwa wskazuje, to właśnie ta część odpowiada za charakterystyczny dla tej rodziny sposób generowania energii potrzebnej do transportu aktywnego, czyli za hydrolizę ATP [10, 16, 27]. Przedstawicielem tej rodziny, mającym zdolność do tworzenia systemu wyrzutu substratów z białkiem błony zewnętrznej TolC, jest system MacAB-TolC. Występuje on u różnych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae i opisywany jest często u E. coli. Pompa ta jest zaangażowana w eksport antybiotyków z grupy makrolidów, ale również białkowych czynników wirulencji bakterii, w tym termostabilnej enterotoksyny II wytwarzanej przez E. coli. Poza tym wykazuje zdolność do transportu glikolipidów błony zewnętrznej, lipopeptydów czy lipopolisacharydów, przez co bierze udział w tworzeniu i naprawie błony zewnętrznej bakterii [28, 29]. W przypadku niedoboru jonów żelaza w otoczeniu system MacAB-TolC może eksportować siderofory [27].

Transportery MFS

Szacuje się, że jest to najliczniejsza klasa pomp efflux i istnieje ich ponad tysiąc, co stanowi prawdopodobnie 25% znanych transporterów. Można je spotkać nie tylko u bakterii, ale również u drożdży, a nawet ssaków [2, 10, 16]. Wszystkie białka należące do przedstawicieli superrodziny MFS są zbudowane w podobny sposób. Mianowicie, pompy te są monomerami, czyli buduje je tylko jeden łańcuch polipeptydowy, składający się z około 400 aminokwasów. Tworzą one dwanaście lub czternaście helis α umiejscowionych w błonie komórkowej. Przy czym te posiadające w swojej budowie więcej helis cechują się większą specyficznością substratową [1]. Przykładem bakteryjnego transportera typu MFS jest kompleks EmrAB-TolC występujący u E. coli [30].

Transportery RND

Rodzina transporterów RND jest jedną z najlepiej poznanych wśród bakterii Gram-ujemnych. Pompy te na tle innych wyróżnia fakt, że jako jedyne warunkują zdolność do wychwytywania szkodliwych substancji zarówno z cytoplazmy, jak i z przestrzeni peryplazmatycznej. Wiąże się to z nietypową strukturą białka zakotwiczonego w błonie wewnętrznej, które u podstawy domeny znajdującej się na terenie cytoplazmy posiada pory umożliwiające ten proces [4]. Opisany mechanizm, a także budowa przykładowego transportera o dobrze znanej strukturze i funkcji, AcrAB-TolC zostały przedstawione na ryc. 3.

Pod względem budowy system AcrAB-TolC przypomina MacAB-TolC. Oba kompleksy posiadają zarówno białko błony wewnętrznej, odpowiednio: MacB i AcrB, kanał zewnętrzny TolC, a także białko peryplazmatyczne MacA oraz AcrA.

Czytaj także: Biochemiczna identyfikacja pałeczek z rodzaju Serratia