Oznaczanie właściwości grzybobójczych materiałów polimerowych

Metoda ASTM G21 opiera się na inkubacji próbek materiałów w obecności wybranych szczepów grzybów strzępkowych, w warunkach wysokiej wilgotności i umiarkowanej temperatury. Grzyby wykorzystywane w teście są organizmami saprotroficznymi, zdolnymi do wykorzystywania związków organicznych zawartych w materiałach jako źródła węgla. Metoda pozwala na wizualną ocenę stopnia porastania materiału przez grzybnię oraz pośrednio ocenę odporności biologicznej materiału [7].

Badane próbki powinny mieć formę płaskich płytek o określonych wymiarach, najczęściej 50 x 50 mm, a ich powierzchnia powinna być reprezentatywna dla struktury materiału końcowego. Próbki są sterylizowane, a następnie umieszczane w inkubatorze nad pożywką o wysokiej wilgotności [7].

W metodzie ASTM G21 wykorzystywane są typowe grzyby środowiskowe o wysokiej aktywności enzymatycznej, w tym: Aspergillus niger, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride i Aureobasidium pullulans.

Grzyby są aplikowane jako zawiesina zarodników na powierzchnię próbek lub na siatkę nad próbkami. Wzrost grzybni przebiega przez okres od 14 do 28 dni w temperaturze 28-30°C i przy wilgotności względnej powyżej 85%.

Ocena wyników w ASTM G21 jest półilościowa i opiera się na wizualnej ocenie próbek pod względem obecności i intensywności wzrostu grzybni. Stosuje się pięciostopniową skalę porastania.

Wyniki klasyfikuje się w skali 0-4 (0 – brak wzrostu, 1 – wzrost śladowy (< 10% powierzchni), 2 – wzrost umiarkowany (10-30%), 3 – znaczny wzrost (30-60%), 4 – rozległy wzrost (60-100%), po 28 dniach inkubacji.

EN 14119 i JIS Z 2911

W ocenie właściwości grzybobójczych materiałów polimerowych, celulozowych i tekstylnych, poza szeroko stosowanymi metodami alternatywnymi, takimi jak ISO 846 czy ASTM G21, istotne znaczenie mają również inne normy krajowe i branżowe. Do ważniejszych należą europejska norma EN 14119 oraz japońska norma JIS Z 2911, które wprowadzają ustandaryzowane procedury testowania odporności na grzyby w kontekście materiałów wykorzystywanych w warunkach podwyższonej wilgotności i zagrożenia mikrobiologicznego.

Metoda według EN 14119

Norma EN 14119:2003 (Plastics and rubber materials with antimicrobial properties – Test method for fungistatic activity) została opracowana przez Europejski Komitet Normalizacyjny (CEN) i ma zastosowanie do materiałów wykazujących działanie fungistatyczne, czyli hamujące rozwój grzybów, bez ich bezpośredniego zabijania [8].

Test polega na naniesieniu zawiesiny zarodników grzybów na powierzchnię badanego materiału, a następnie inkubacji w kontrolowanych warunkach środowiskowych (zwykle 28-30°C, wilgotność względna powyżej 85%) przez okres od 7 do 28 dni. W trakcie inkubacji i po jej zakończeniu ocenia się stopień porastania powierzchni materiału przez grzybnię oraz zmiany wizualne (przebarwienia, zmatowienie, degradację powierzchni).

Do badania wykorzystuje się wyselekcjonowane szczepy grzybów strzępkowych typowych dla środowisk o dużej wilgotności, w tym Aspergillus niger, Penicillium funiculosum oraz Chaetomium globosum.

Ocena skuteczności działania fungistatycznego odbywa się wizualnie, według skali porastania powierzchni próbki przez grzybnię. Materiały klasyfikowane są jako:

• odporne (fungistatyczne) – brak lub minimalny wzrost grzybów,
• nieodporne – wyraźny, rozległy wzrost mikroflory.

EN 14119 zakłada także możliwość zastosowania metod ilościowych, np. oceny liczby komórek grzybowych lub pomiaru zmian masy próbki, jednak głównym kryterium pozostaje ocena wizualna.

Norma znajduje zastosowanie głównie w badaniu materiałów:

• do zastosowań wewnętrznych (np. wykładziny, meble, urządzenia AGD),
• o przeznaczeniu higienicznym (np. panele ścienne, blaty, elementy sanitarne),
• z dodatkami biobójczymi (np. na bazie srebra, miedzi lub związków organicznych) [8].

Metoda według JIS Z 2911

Norma JIS Z 2911:2010 (Methods of test for fungi resistance of building materials) została opracowana przez Japanese Industrial Standards i służy do oceny odporności grzybobójczej materiałów budowlanych, takich jak: drewno, płyty wiórowe, płyty gipsowe, tapety czy panele dekoracyjne. Norma ta jest znana z rygorystycznego podejścia do oceny materiałów w warunkach symulujących środowisko tropikalne lub wilgotne [9].

Test polega na inkubacji badanych próbek w obecności kilku gatunków grzybów strzępkowych przez 28 dni, w temperaturze 29±1°C i wilgotności względnej powyżej 90%. Materiały umieszczane są na siatkach lub rusztach nad pożywką stałą, przy jednoczesnym zachowaniu kontaktu z mikroflorą przez cały czas trwania testu.

W badaniu wykorzystywane są zarówno typowe gatunki środowiskowe, jak: Aspergillus niger, Penicillium citrinum, Trichoderma viride, Chaetomium globosum, jak i szczepy tropikalne, co odróżnia tę normę od europejskich i amerykańskich odpowiedników.

Ocena odporności odbywa się na podstawie stopnia porastania próbki przez grzybnię, określanego wizualnie według pięciostopniowej skali: 0 – brak wzrostu, 1 – śladowy wzrost(< 10%), 2 – lekki wzrost (10-30%), 3 – umiarkowany wzrost (30-60%), 4 – silny wzrost(> 60% powierzchni pokrytej grzybnią).

Zestawienie porównawcze omawianych norm

W tab. 1 i 2 przedstawiono różnice w zastosowaniu omawianych norm.

Techniki laboratoryjne wykorzystywane do oceny

• Ocena wizualna, subiektywna, ale szeroko stosowana.
• Pomiar aktywności enzymatycznej – oznaczanie dehydrogenazy.
• Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) – analiza kolonizacji i morfologii grzybów na powierzchni.
• Spektroskopia FTIR i analiza termiczna (TGA, DSC) – badanie degradacji.
• Barwienie fluorescencyjne (DAPI) – do wykrycia struktur komórkowych grzybów.

Wyzwania i przyszłość badań

• Brak jednoznacznych progów skuteczności – konieczność lepszej korelacji między wynikami in vitro i rzeczywistymi warunkami środowiskowymi.
• Potrzeba rozwoju metod ilościowych, np. opartych o qPCR lub spektroskopię.
• Rosnące znaczenie ekologicznych dodatków grzybobójczych, np. ekstraktów roślinnych czy enzymów.
• Potrzeba badań długoterminowej trwałości efektu grzybobójczego w realnych warunkach użytkowania (np. w warunkach wysokiej wilgotności, UV).

Wnioski

Oznaczanie właściwości grzybobójczych materiałów polimerowych jest złożonym procesem, wymagającym zastosowania normatywnych oraz nowoczesnych technik badawczych. Dynamiczny rozwój materiałów bioaktywnych, takich jak nanokompozyty i polimery biodegradowalne, stwarza nowe możliwości w projektowaniu powierzchni odpornych na kolonizację grzybową. Standaryzacja metod oraz rozwój obiektywnych technik ilościowych stanowią klucz do dalszego postępu w tej dziedzinie.

Piśmiennictwo

1. Piontek M. et al.: Fungal interactions with polymer surfaces: Risk and mitigation. „Materials Today: Proceedings”, 2022, 60, 41-48.
2. Kong M., Chen X.G., Xing K., Park H.J.: Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review. „International Journal of Food Microbiology”, 2010, 144 (1), 51-63.
3. Zhao X., et al.: Surface modification of polymers to prevent fungal colonization. „Progress in Organic Coatings”, 2020, 147, 105856.
4. Ghannoum M.A., Rice L.B.: Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. „Clinical Microbiology Reviews”, 1999, 12 (4), 501-517.
5. Marambio-Jones C., Hoek E.M.V.: A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. „Journal of Nanoparticle Research”, 2010, 12 (5), 1531-1551.
6. ISO 846:2019. Plastics – Evaluation of the action of microorganisms.
7. ASTM G21-15. Standard Practice for Determining Resistance of Synthetic Polymeric Materials to Fungi.
8. EN 14119:2003. Plastics and rubber materials with antimicrobial properties – Test method for fungistatic activity. Brussels: European Committee for Standardization.
9. JIS Z 2911:2010. Methods of test for fungi resistance of building materials.Tokyo: Japanese Industrial Standards Committee (JISC).
10. PN-EN 15457:2014-10. Badanie skuteczności środków ochrony powłok farb i lakierów przed grzybami.
11. Monteiro D.R. et al.: Silver nanoparticles incorporated in polyvinyl alcohol: Potential antifungal materials for biomedical devices. „International Journal of Antimicrobial Agents”, 2009, 34 (2), 103-110.

dr hab. Agnieszka Richert, prof. UMK
Instytut Biologii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Czytaj także: Jak zbadać farby i lakiery pod względem biobójczym?