Oznaczanie węglowodanów w produktach spożywczych techniką chromatografii jonowej
HPAEC-PAD jest użyteczną i najpopularniejszą techniką z grupy IC stosowaną do oznaczania węglowodanów w próbkach żywności i nie tylko.
Głównym celem analizy żywności jest kontrola składu i jakości spożywanych przez konsumentów produktów. Szczególne znaczenie ma monitorowanie zawartości potencjalnie toksycznych substancji chemicznych wykrywanych w żywności, ale także kontrola procesów technologicznych podczas jej wytwarzania. Przykładami substancji, które mogą wywierać niekorzystny wpływ na zdrowie ludzi, oznaczanych w żywności metodami chromatografii jonowej (IC), są nieorganiczne i organiczne jony oraz wybrane metale i metaloidy [1]. Występowanie tych substancji w produktach żywnościowych może być odzwierciedleniem ich zawartości w środowisku naturalnym, głównie w glebie, wodach opadowych i gruntowych, lub konsekwencją ich wprowadzania do żywności na etapie jej przetwarzania. Konsumenci domagają się zdrowych i bezpiecznych produktów spożywczych, które są dobrze zidentyfikowane pod względem pochodzenia i zawartości poszczególnych substancji chemicznych. W związku z tym ważne jest określenie ich autentyczności i rzeczywistego składu chemicznego w porównaniu do składu deklarowanego przez producenta [2]. Jedną z ważnych grup substancji obecnych i oznaczanych w żywności są cukry.
Węglowodany to szeroka grupa związków organicznych mających podobną budowę, ale zróżnicowane właściwości fizykochemiczne i zastosowania. Dzielimy je na: monosacharydy (cukry proste); oligosacharydy (od 2-9 cząsteczek monosacharydów, wśród których najbardziej popularne są disacharydy) oraz polisacharydy. Typowymi monosacharydami są: glukoza, fruktoza, mannoza i galaktoza. Przykładowe disacharydy to: maltoza, sacharoza oraz laktoza, a typowe polisacharydy to: skrobia, glikogen, dekstran i celuloza. Cukry są naturalnie występującymi w przyrodzie składnikami pokarmowymi. Wszystkie rośliny, z których produkuje się środki spożywcze, w tym owoce, warzywa czy zboża, zawierają naturalnie obecne cukry. Są one również naturalnie obecne w mleku i jego przetworach oraz w miodzie. Węglowodany dostarczają organizmowi energii, która ma zasadnicze znaczenie dla optymalnego funkcjonowania mózgu, mięśni i układu nerwowego. Zawarta w pożywieniu glukoza bardzo łatwo się wchłania, a ponadto pełni szczególną i istotną rolę jako najkorzystniejsze źródło energii dla mózgu.
Oznaczanie węglowodanów w produktach spożywczych techniką IC
Istnieje wiele metod oznaczania węglowodanów zarówno fizycznych, jak i chemicznych [3]. Spośród tych drugich dominującą jest wysokosprawna chromatografia anionowymienna z detektorem amperometrycznym (HPAEC) [4].
Możliwości zastosowań pulsacyjnego detektora amperometrycznego zostały opisane w pracy Johnsona [5], który już w roku 1986 opublikował artykuł na ten temat w czasopiśmie „Nature”. Od samego początku doceniano potencjał układu HPAEC-PAD w analizie węglowodanów, a w kolejnych latach stała się ona dominującą techniką analityczną w tym zakresie.
Już w przyszłym roku będziemy obchodzili 50-lecie powstania chromatografii jonowej (IC), jako komercyjnie dostępnej techniki analitycznej, bez której trudno wyobrazić sobie współcześnie funkcjonujące laboratorium działające w zakresie badań wód i ścieków (i nie tylko) [6].
IC jest odmianą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, a jej początki wywodzą się z chromatografii jonowymiennej [7]. Warto w tym miejscu przypomnieć nie tylko nomenklaturowe różnice pomiędzy wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) i chromatografią jonową (IC).
Pomimo że jest ich wiele, często w literaturze są one stosowane zamiennie, szczególnie w przypadku analiz substancji jonowych. Chromatografia jonowa, jako odmiana wysokosprawnej chromatografii cieczowej wymaga stosowania tych samych lub podobnych urządzeń (pompy, dozowniki, detektory), jakie stosowane są w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Dlatego stosując zamiennie określenia IC i HPLC (a szczególnie HPAEC), musimy pamiętać o różnych fazach stacjonarnych i wynikających z nich mechanizmach rozdzielania oraz stosowanych eluentach i metodach detekcji. Przyrząd do HPLC nie jest formalnie chromatografem jonowym m.in. ze względu na to, że stosowana w nim metalowa głowica pompy nie powinna być w IC stosowana, ze względu na ryzyko wymywania metali podczas np. analizy jonów metali czy metaloidów.
Do najważniejszych zastosowań IC należy oznaczanie nieorganicznych i organicznych anionów oraz kationów, a także innych substancji, które można przeprowadzić w formy jonowe [8]. Wprowadzanie nowych rodzajów faz stacjonarnych, metod przygotowania próbek i metod detekcji pozwala rozszerzyć zakres tych zastosowań o nowe rodzaje analitów i matryc.
Chromatografia jonowa i techniki pokrewne, takie jak chromatografia wykluczania jonów oraz chromatografia par jonowych odgrywają obecnie coraz większą rolę w badaniach nie tylko próbek wód i ścieków, ale i próbek biologicznych, medycznych, przemysłowych oraz żywności [9, 10]. O ile chromatografia jonowa to metoda referencyjna w badaniach wód i ścieków [11, 12], w przypadku produktów spożywczych (nie licząc wody) istnieje póki co tylko jedna norma wykorzystująca IC, tj. PN-EN 12014-4 (2006) Artykuły żywnościowe – Oznaczanie zawartości azotanów i/lub azotynów. Część 4: Oznaczanie zawartości azotanów i azotynów w produktach mięsnych metodą chromatografii jonowymiennej (IC).
HPAEC opiera się na zasadzie, że cukry dysocjują na aniony w środowisku zasadowym. Cukry zawierają wiele grup hydroksylowych, które są aktywne elektrochemicznie. Neutralne i kwaśne monosacharydy i oligosacharydy w takich warunkach dysocjują do form anionowych, które mogą być rozdzielane w kolumnach anionowymiennych.
Najczęściej wykorzystywanym eluentem jest NaOH w szerokim zakresie stężeń od kilku do kilkuset mM/L. Jony OH– pełnią zarówno funkcję jonów eluujących, jak i określają wartość pH fazy ruchomej. Zmiana ich stężenia w fazie ruchomej wpływa istotnie na czasy retencji. Podczas gdy dysocjacja węglowodanów, a w konsekwencji czasy retencji wzrastają wraz ze wzrostem wartości pH, związane z tym wyższe stężenie jonów eluentu powoduje skracanie czasów retencji. Dopóki węglowodany nie są w pełni zdysocjowane, te dwa efekty kompensują się nawzajem. Przy całkowitej dysocjacji węglowodanów dalszy wzrost stężenia jonów OH– powoduje jedynie zmniejszenie czasów retencji. Węglowodany o wysokim powinowactwie do fazy stacjonarnej można analizować, dodając do eluentu octan sodu. Przyspiesza on elucję silnie związanych związków i zapewnia lepszą kontrolę selektywności. Ponieważ optymalna wartość pH dla układu HPAEC-PAD wynosi 13, stężenie NaOH wynosi np. 0,1 mol/L i jest ono utrzymywane na stałym poziomie, do którego podczas rozdzielania dodawane są coraz większe ilości octanu sodu. Przygotowując eluenty na bazie wodorotlenków, należy zwrócić szczególną uwagę, aby były one wolne od węglanów, ponieważ obecność nawet niewielkich ilości pogarsza rozdzielczość. Eluenty powinny być przygotowywane z koncentratu, a woda dejonizowana używana do przygotowania fazy ruchomej musi być dokładnie odgazowana np. helem. Jak wspomniano wcześniej, w zakresie oznaczania węglowodanów najbardziej użyteczny jest detektor amperometryczny. Detekcja amperometryczna opiera się na pomiarze prądu elektrycznego, który występuje w procesie utleniania (redukcji) cząsteczek analitu na powierzchni elektrody roboczej przy określonym potencjale. Detektor amperometryczny wykazuje szereg zalet: niską granicę wykrywalności (10-7-10-15 g w zależności od charakteru badanego związku); małą objętość komory (0,01-5 μL), która zapewnia możliwość pracy z kolumnami o dowolnym rozmiarze; prostą konstrukcję i niskie koszty eksploatacji. Przykładowy chromatogram rozdzielania 4 cukrów z wykorzystaniem tego typu detektora przedstawiono na rys. 1.
Podstawą rozdzielania w kolumnach stosowanych do oznaczania węglowodanów techniką chromatografii jonowej są cztery główne mechanizmy separacji: filtracja żelowa, wymiana jonowa, podział i adsorpcja. Filtracja żelowa była pierwszym zastosowanym mechanizmem do rozdzielania węglowodanów i pomimo długiego czasu związanego z rozdzielaniem i słabą rozdzielczością, mechanizm ten umożliwił rozdzielenie węglowodanów zgodnie z ich masą cząsteczkową, co obecnie jest wykorzystywane głównie do analizy polisacharydów [13].
Bądź na bieżąco z nowościami z branży
Dołącz do odbiorców newslettera!
