Metody oznaczania zawartości białek glutenowych w żywności bezglutenowej

Stwierdzono, że zastosowanie metod RP-HPLC i HPCE jest pośrednie między SDS-PAGE oraz MALDI-TOF-MS. Zarówno RP-HPLC, jak i HPCE wykazały wyższą rozdzielczość i powtarzalność w porównaniu z SDS-PAGE, ale mniejszą moc detekcji niż MALDI-TOF-MS. Warto zauważyć, że MALDI-TOF-MS nadaje się do analizy frakcji gliadynowej, do rutynowych badań przesiewowych linii hodowlanych i do identyfikacji nowych genotypów [41].

Biosensory

Biosensory można uznać za przodującą technologię, gdyż stanowią potencjalną alternatywę dla konwencjonalnych metod analitycznych, takich jak HPLC, GC i MS, a także są w stanie zapewnić prawdopodobnie jeden z najbardziej obiecujących sposobów łatwej identyfikacji związków chemicznych. Po pierwsze, dzięki szybkim pomiarom, specyficzności, czułości (w zakresie nanomolowym i femtomolowym) oraz wysokiej automatyzacji. Biosensory umożliwiają pomiary w czasie rzeczywistym i dokonują wysokoprzepustowej analizy w całym łańcuchu produkcyjnym. Integracja wysokiej specyficzności składników rozpoznawania biologicznego z wyjątkowymi właściwościami optycznymi i elektrochemicznymi nanomateriałów zapewnia nowe, interesujące alternatywy dla konwencjonalnych testów, poprawiając czułość, wytrzymałość i wydajność istniejących technik. Wśród różnych wad powstrzymujących rozwój tej technologii są testy prototypów w rzeczywistych próbkach pozostających w krytycznej fazie, z powodu unieruchomienia biosensora, przygotowania próbki, stabilności, analizy w złożonych matrycach i pomiarów w czasie rzeczywistym. Ta kombinacja wyzwań wciąż ogranicza komercjalizację biosensorów i w konsekwencji ich zastosowanie. Potrzebne są dalsze szczegółowe badania, aby przenieść technologię biosensorów z badań laboratoryjnych na komercyjne. Kluczowymi celami w produkcji biosensorów możliwych do wprowadzenia na rynek mogą być izolacja i produkcja opłacalnych komponentów biologicznych, minimalizacja kosztów urządzeń i testy walidacyjne przeprowadzane przez agencje regulacyjne. Ponadto muszą być bardzo wrażliwe, selektywne, zintegrowane i gotowe do użycia. Analiza żywności i wody stanowi obiecujące pole zastosowań do analizy multipleksowej opartej na gamie układów fluorescencyjnych, chemiluminescencyjnych, elektrochemicznych, hybrydowych układów elektrochemiczno-optycznych w połączeniu z układem płynów [42].

Dotychczas opracowano m.in. elektrochemiczny magnetyczny czujnik immunoenzymatyczny do wykrywania fragmentów gliadyny w naturalnych lub przetworzonych próbkach żywności (takich jak piwo i odtłuszczone mleko). Po raz pierwszy gliadyna została unieruchomiona na aktywowanych tosylem perełkach magnetycznych poprzez kowalencyjne sprzęganie, osiągając zarówno doskonałą skuteczność wiązania (blisko 90%), jak i dobrą orientację epitopową. Wydajność elektrochemicznego magnetoelektrycznego czujnika czułości została porównana z magneto-ELISA (wykonanym w mikropłytkach z detekcją optyczną), osiągając w obu przypadkach podobne wartości granicy wykrywalności. Magneto-immunosensor potrafi analizować gluten lub mały fragment glutenu w żywności naturalnej lub poddanej obróbce wstępnej, a także w próbkach żywności bezglutenowych, o ile maksymalne dopuszczalne wartości są prawie 1000 razy wyższe. Ponadto próbki żywności można rozcieńczać 400 razy, zmniejszając efekt matrycy żywnościowej. Ze względu na właściwości elektrochemicznego rezonansu magnetycznego, strategia ta może być odpowiednia do szybkiej, przeprowadzanej na miejscu i przesiewowej analizy gliadyny w produktach spożywczych. Wysoka czułość materiału zastosowanego w elektrodach m-GEC, dodana do jego kompatybilności z miniaturyzacją i technologiami masowej obróbki, przekształca je w bardzo atrakcyjne, tanie i przyjazne dla użytkownika urządzenia do szybkiego zastosowania w przemyśle spożywczym [43].

Mikroprzepływowy czujnik (sensor) biologiczny ELISA to niedrogie, szybkie, zminiaturyzowane i bardzo czułe urządzenie do wykrywania alergenów pokarmowych. Opracowany mikroprzepływowy biosensor znacząco skraca czas detekcji z 4 h do 20 min, a także zmniejsza użycie kosztownych odczynników i próbek (do 20 razy) przy zachowaniu najwyższej czułości i korzystnie wpływa na komercyjne zestawy ELISA do glutenu pszennego oraz alergennego białka Ara h 1 w próbkach żywności [44].

Podsumowanie

Reasumując, jakościowa i ilościowa analiza białek glutenowych jako silnych alergenów, jest możliwa wyłącznie przy pomocy nowatorskich metod badawczych skorelowanych z nowoczesną, a przy tym kosztowną aparaturą analityczną. Dla osób zmagających się z alergią kontakt nawet z niewielką dawką alergenu może wpłynąć na wyraźne pogorszenie ich stanu zdrowia. Dlatego tak ważna jest zarówno znajomość, jak i umiejętność odpowiedniego stosowania wymienionych metod analitycznych, służących detekcji białek glutenowych, szczególnie w żywności bezglutenowej, po którą sięgają chorzy na celiakię.

Piśmiennictwo

1. Woodward J.: Coeliac disease, „Medicine”, 2011, 39(3), 173-177.
2. Bubis E., Przetaczek-Rożnowska I.: Gluten i choroby wynikające z jego nietolerancji, „Kosmos. Problemu Nauk Biologicznych”, 2016 , 65(2), 293-302.
3. Shewry P. R., Halford N. G., Belton P. S., Tatham A. S.: The structure and properties of gluten: an elastic protein from wheat grain. „Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences”, 2002, 357(1418), 133-142.
4. Tilley K. A., Benjamin R. E., Bagorogoza K. E., Okot-Kotber B. M., Prakash O., Kwen H.: Tyrosine cross-links: molecular basis of gluten structure and function, „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2001, 49(5), 2627-2632.
5. Delcour J. A., Joye I. J., Pareyt B., Wilderjans E., Brijs K., Lagrain B.: Wheat gluten functionality as a quality determinant in cereal-based food products, „Annual Review of Food Sscience and Technology”, 2012, 3, 469-492.
6. Auricchio S., Troncone R.:  History of coeliac disease, „European Journal of Pediatrics”, 1996, 155(6), 427-428.
7. Gee S.: On the coeliac disease, „Saint Bartholomew’s Hospital Reports”, 1888, 24, 17-20.
8. Herter C. A.: On Infantilism from Chronic Intestinal Infection: Characterized by the Overgrowth and Persistence of Flora of the Nursling Period. A Study of the Clinical Course, Bacteriology, Chemistry and Therapeutics of Arrested Development in Infancy. Macmillan,  1908.
9. Dicke W. K., Weijers H. A., Kamer J. V. D.: Coeliac Disease The Presence in Wheat of a Factor Having a Deleterious Effect in Cases of Coeliac Disease, „Acta Paediatrica”, 1953, 42(1), 34-42.
10. Rubin C. E., Brandborg L. L., Flick A. L., Phelps P., Parmentier C., Van Niel S.: Studies of celiac sprue. 3. The effect of repeated wheat instillation into the proximal ileum of patients on a gluten free diet, „Gastroenterology”, 1962, 43, 621-641.
11. Falchuk Z. M., Strober W.: Gluten-sensitive enteropathy: synthesis of antigliadin antibody in vitro, „Gut”, 1974, 15(12), 947-952.
12. Di Sabatino A., Corazza G. R.: Coeliac disease, „The Lancet”, 2009, 373(9673), 1480-1493.
13. Lebwohl B., Sanders D. S., Green P. H.: Coeliac disease, „The Lancet’, 2018, 391(10115), 70-81.
14. Rozporządzenie Wykonawcze Komisji (UE) Nr 828/2014 z dnia 30 lipca 2014 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat nieobecności lub zmniejszonej zawartości glutenu w żywności. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 228/5.
15. Daniewski W., Wojtasik A., & Kunachowicz H.: Gluten content in special dietary use gluten-free products and other food products, „Roczniki Państwowego Zakładu Higieny”, 2010, 61(1), 51-55.
16. Akutko K., Pytrus T., & Iwańczak B.: Nieceliakalna nadwrażliwość na gluten–charakterystyka i leczenie, „Pediatria Polska”, 2016 , 91(4), 345-349.
17. Hozyasz K.: Nieceliakalna nadwrażliwość na gluten (NCNG) – choroba ponownie odkryta, „Family Medicine & Primary Care Review”, 2016, 1, 79-83.
18. Skerritt J. H., Hill A. S., Detecting Gluten and Related Prolamins in Food. In: „Coeliac Disease”, Springer, Dordrecht, 1991, 85-94.
19. Thompson T., Méndez E.: Commercial assays to assess gluten content of gluten-free foods: why they are not created equal, „Journal of the American Dietetic Association”, 2008, 108(10), 1682-1687.
20. Ellis H. J., Rosen-Bronson S., O’Reilly N., Ciclitira P. J.: Measurement of gluten using a monoclonal antibody to a coeliac toxic peptide of A gliadin, „Gut”, 1998, 43(2), 190-195.
21. Méndez E., Vela C., Immer U., Janssen F. W.: Report of a collaborative trial to investigate the performance of the R5 enzyme linked immunoassay to determine gliadin in gluten-free food,  „European Journal of Gastroenterology & Hepatology”, 2005, 17(10), 1053-1063.
22. Osman A. A., Uhlig H. H., Valdes I., Amin M., Méndez E., Mothes T.: A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins, „European Journal of Gastroenterology & Hepatology”, 2001, 13(10), 1189-1193.
23. Shan L., Qiao S. W., Arentz-Hansen H., Molberg Ø., Gray G. M., Sollid L. M., Khosla C.: Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue, „Journal of Proteome Research”, 2005, 4(5), 1732-1741.
24. Morón B., Cebolla A., Manyani H., Alvarez-Maqueda M., Megías M., Thomas M. D. C. & Sousa C.: Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide, „The American Journal of Clinical Nutrition”, 2008, 87(2), 405-414.
25. Cabrera-Chávez F., Iametti S., Miriani M., de la Barca A. M. C., Mamone G., Bonomi F.: Maize prolamins resistant to peptic-tryptic digestion maintain immune-recognition by IgA from some celiac disease patients, „Plant Foods for Human Nutrition”, 2012, 67(1), 24-30.
26. Ortiz-Sánchez J., Cabrera-Chávez F., de la Barca A.: Maize prolamins could induce a gluten-like cellular immune response in some celiac disease patients, „Nutrients”, 2013, 5(10), 4174-4183.
27. Mujico J. R., Lombardía M., Mena M. C., Méndez E., Albar J. P.: A highly sensitive real-time PCR system for quantification of wheat contamination in gluten-free food for celiac patients,  „Food Chemistry”, 2011, 128(3), 795-801.
28. Olexova L., Dovičovičová L., Švec M., Siekel P., & Kuchta T.: Detection of gluten-containing cereals in flours and “gluten-free” bakery products by polymerase chain reaction, „Food Control”, 2006, 17(3), 234-237.
29. Mašková E., Paulíčková I., Rysová J., Gabrovská D.: Evidence for wheat, rye, and barley presence in gluten free foods by PCR method-comparison with ELISA method, „Czech Journal of Food Sciences”, 2011, 29(1), 45-50.
30. Camerlengo F., Sestili F., Silvestri M., Colaprico G., Margiotta B., Ruggeri R., & Lafiandra D.: Production and molecular characterization of bread wheat lines with reduced amount of α-type gliadins, „BMC Plant Biology”, 2017, 17(1), 248.
31. Lookhart G. L., Bean S. R.: Ultrafast CE analysis of cereal storage proteins and its applications to protein characterization and cultivar differentiation, „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2000, 48, 344-353.
32. Li J., Wang S., Yu Z., Li X., Guo G., Feng S., & Yan Y.: Optimization and development of capillary electrophoresis for separating and identifying wheat low molecular weight glutenin subunits, „Journal of Cereal Science”, 2012, 55(2), 254-256.
33. Han C., Yu Z., Feng S., Lv D., Yan X., Chen G., & Yan, Y.: Applications of capillary electrophoresis for rapidly separating and characterizing water-soluble proteins of wheat grains, „Cereal Research Communications”, 2013, 41(4), 601-612.
34. Wieser H., Antes S., Seilmeier W.: Quantitative determination of gluten protein types in wheat flour by reversed‐phase high‐performance liquid chromatography, „Cereal Chemistry”, 1998, 75(5), 644-650.
35. Larroque O. R., Bekes F., Wrigley C. W., Rathmell W. G.: Analysis of gluten proteins in grain and flour blends by RP-HPLC. In: Wheat gluten. Proceedings of the 7^th International Workshop Gluten 2000, Bristol, UK, 2-6 April 2000. „Royal Society of Chemistry”, pp. 136-139.
36. Yu Z., Han C., Yan X., Li X., Jiang G., & Yan Y.: Rapid characterization of wheat low molecular weight glutenin subunits by ultraperformance liquid chromatography (UPLC), „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2013, 61(17), 4026-4034.
37. Haraszi R., Chassaigne H., Maquet A., Ulberth F.: Analytical methods for detection of gluten in food − method developments in support of food labeling legislation, „Journal of AOAC International”, 2011, 94(4), 1006-1025.
38. Ferreira M. S., Mangavel C., Rogniaux H., Bonicel J., Samson M. F., Morel M. H.: A MALDI-TOF based study of the in-vivo assembly of glutenin polymers of durum wheat, „Food Research International”, 2014, 63, 89-99.
39. Liu L., Wang A., Appels R., Ma J., Xia X., Lan P., … & Ma W.: A MALDI-TOF based analysis of high molecular weight glutenin subunits for wheat breeding, „Journal of Cereal Science”, 2009, 50(2), 295-301.
40. Mejías J., Lu X., Osorio C., Ullman J., von Wettstein D., Rustgi S.: Analysis of wheat prolamins, the causative agents of celiac sprue, using reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), „Nutrients”, 2014, 6(4), 1578-1597.
41. Gao L., Ma W., Chen J., Wang K., Li J., Wang S., … & Yan Y.: Characterization and comparative analysis of wheat high molecular weight glutenin subunits by SDS-PAGE, RP-HPLC, HPCE, and MALDI-TOF-MS, „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2010, 58(5), 2777-2786.
42. Scognamiglio V., Arduini F., Palleschi G., & Rea G.: Biosensing technology for sustainable food safety, „Trends in Analytical Chemistry”, 2014, 62, 1-10.
43. Laube T., Kergaravat S. V., Fabiano S. N., Hernández S. R., Alegret S., Pividori M. I.: Magneto immunosensor for gliadin detection in gluten-free foodstuff: Towards food safety for celiac patients, „Biosensors and Bioelectronics”, 2011, 27(1), 46-52.
44. Weng X., Gaur G., Neethirajan S.: Rapid detection of food allergens by microfluidics ELISA-based optical sensor, „Biosensors”, 2016, 6(2), 24.

dr inż. Karolina Pycia
dr inż. Joanna Kaszuba
prof. dr hab. inż. Grażyna Jaworska
Katedra Ogólnej Technologii Żywności i Żywienia Człowieka, Wydział Biologiczno-Rolniczy, Uniwersytet Rzeszowski

Czytaj także: Derywatyzacja w chromatografii gazowej. Ocena skuteczności procedur w analityce związków pochodzenia naturalnego i zanieczyszczeń środowiska