Metody oznaczania zawartości białek glutenowych w żywności bezglutenowej

TITLE: Methods for determining the content of gluten proteins in gluten-free foods

STRESZCZENIE: Celiakia, zwana także chorobą trzewną, polega na trwałej nietolerancji pokarmowej glutenu. Spożycie żywności, w której występują nawet niewielkie ilości glutenu, prowadzi do uszkodzenia błony śluzowej jelita cienkiego, a w efekcie do zaburzenia wchłaniania oraz niedożywienia organizmu. Ważne jest więc zarówno odpowiedzialne postępowanie w zakresie doboru żywności przez osoby zmagające się z tym schorzeniem, jak i podawanie rzetelnej informacji o możliwości zanieczyszczenia produktu glutenem na etykiecie opakowania, co leży w kwestii producentów żywności. Objawy związane z chorobą występują nawet na skutek przyjęcia niewielkiej dawki białek glutenowych. Dlatego też kontrola żywności bezglutenowej (gluten-free) w zakresie obecności tych białek powinna być prowadzona przy użyciu czułych oraz precyzyjnych metod badawczych. Głównym celem artykułu jest charakterystyka metod badawczych służących detekcji białek glutenowych w żywności gluten-free.

SŁOWA KLUCZOWE: gluten, celiakia, alergia, PCR, ELISA, biosensory, chromatografia

SUMMARY: Coeliac disease is a persistent gluten intolerance. The consumption of food containing even small amounts of gluten leads to the damage of the mucous membrane of the small intestine and, as a result, to malabsorption and malnutrition. Therefore it is so important that people suffering from the disease select food responsibly, and food manufacturers provide reliable information about the possibility of contaminating a food product with gluten on its packaging. The consumption of even a small dose of gluten proteins causes the symptoms of the disease. Therefore, the control of gluten-free foods for the presence of these proteins should be carried out using sensitive and precise research methods. The main purpose of the article is to characterize research methods used for the detection of gluten proteins in gluten-free foods.

KEYWORDS: gluten, coeliac disease, allergy, PCR, ELISA, biosensors, chromatography

Zdrowie osób zmagających się z celiakią może ulec wyraźnemu pogorszeniu przy kontakcie nawet z niewielką ilością alergenu.

Przewlekła nietolerancja glutenu jest podstawą występowania celiakii, czyli choroby trzewnej o podłożu genetycznym. Metodą ograniczenia jej rozwoju jest całkowita eliminacja z diety produktów zawierających białka glutenowe. Klasyczna dieta bezglutenowa polega na zastąpieniu produktów spożywczych na bazie tradycyjnych zbóż (pszenica, jęczmień, żyto) ich bezglutenowymi odpowiednikami naturalnie wolnymi od glutenu lub z których gluten został usunięty. Produkty tego typu zaliczane są do środków spożywczych specjalnego przeznaczenia żywieniowego, adresowanych do osób zmagających się z celiakią. Gluten występuje w ziarnie pszenicy, która zaliczana jest do tzw. „wielkiej ósemki” wykazującej działanie alergenne. W ramach tej grupy można wyróżnić także: mleko krowie, jaja, ryby, skorupiaki, orzechy, orzeszki ziemne oraz soję. Nie znaleziono go w ziarnie ryżu, kukurydzy lub prosa. Jednak nadal toksyczność białek owsa pozostaje kontrowersyjna, gdyż kontaminacja krzyżowa z innymi zbożami w czasie mielenia może odpowiadać za większość doniesień dotyczących przetworów owsianych wywołujących celiakię [1]. Dla osób stosujących dietę bezglutenową ważne jest, aby produkty, po które sięgają, były z całą pewnością wolne od glutenu. Identyfikację alergenów, w tym białek glutenowych, można przeprowadzić przy użyciu czułych metod analitycznych opartych głównie na technikach immunologicznych, chromatograficznych czy elektroforetycznych.

Gluten a celiakia

Definicja glutenu nie jest jednoznaczna, gdyż jest uzależniona od dziedziny nauki, w ramach której gluten oraz jego właściwości są analizowane. W przypadku nauk rolniczych, a ściślej technologii żywności i żywienia, gluten rozumiany jest jako elastyczny kompleks powstały po wymyciu skrobi z ciasta wytworzonego z mąki pszennej oraz wody [2]. Ilość oraz jakość glutenu kształtują wartość mąki, gdyż wyjątkowe właściwości pszenicy są uwarunkowane głównie obecnością białek zapasowych, w tym białek glutenu. Tworzą one ciągłą białkową matrycę w komórkach dojrzałego suchego ziarna i są łączone w celu utworzenia ciągłej lepkosprężystej sieci, gdy mąka jest mieszana z wodą w celu wytworzenia ciasta [3]. Tworzenie się struktury glutenu, podczas mieszania ciasta i procesu pieczenia chleba, jest niezwykle złożone. Ustalono, że specyficzna podgrupa białek glutenowych − glutenin – bezpośrednio wpływa na tworzenie ciasta i jakość otrzymanego z niego chleba. Struktura siatki glutenowej tworzy się w wyniku agregacji cząsteczek gliadyny i gluteniny w obecności wody, łączonych poprzez wiązania disulfidowe i wodorowe oraz oddziaływania hydrofobowe. Wiele badań strukturalnych białek, a także badań struktury ciasta pszennego i procesu pieczenia, pozwala wskazać na fakt, że to wiązania disulfidowe są podstawowym elementem struktury białek glutenowych. Tworzenia wspomnianych wiązań disulfidowych (SS) ma miejsce na drodze utlenienia grupy sulfhydrylowej (SH) [4]. Zatem mąka pszenna jest doskonałym surowcem do produkcji chleba, w którym białka glutenowe przyczyniają się do właściwości ciasta, objętości i struktury chleba oraz do produkcji makaronów, w których białka glutenowe generują pożądane cechy kulinarne gotowego wyrobu. Ponadto można przypuszczać, że struktura i tekstura innych produktów z ziarna pszenicy są również, przynajmniej w pewnym stopniu, kształtowane zmianami we frakcji białek glutenu [5]. FAO/WHO także wskazują, że gluten jest nierozpuszczalną w wodzie oraz 0,5 M NaOH frakcją białka występującą w ziarnie pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa oraz ich odmianach mieszańcowych. Natomiast definicja uznana w naukach medycznych raczej nie odnosi się do właściwości technologicznych glutenu, a informuje o rozpuszczalnych w etanolu frakcjach prolaminy w ziarnie pszenicy, sekaliny w ziarnie żyta oraz hordeiny w ziarnie jęczmienia i powodowaniu przez nie uszkodzeń komórek jelita cienkiego. Jak wynika z doniesień naukowych, stopień uszkodzenia komórek jelita cienkiego zależy od zawartości azotu we frakcji prolamin, jej składu oraz sekwencji aminokwasów. Wykazano, że najbardziej toksyczne są fragmenty prolamin bogate w prolinę przy N-końcu gliadyny [2].

Choroba trzewna, czyli celiakia

Alergie pokarmowe są bardzo groźnym czynnikiem dla zdrowia ludzkiego. Klasyfikowane są w jednej grupie z AIDS, chorobami nowotworowymi oraz chorobami krążenia jako schorzenia najbardziej niebezpieczne dla zdrowia. Podstawą alergii są alergeny, wśród których występuje gluten wywołujący nasilenie celiakii.

Zaburzenie związane ze spożywaniem produktów zawierających gluten prawdopodobnie było znane już w starożytnej Grecji [6]. Pod koniec XIX wieku doktor Samuel Gee (Wielka Brytania) jako pierwszy zauważył, że choroba trzewna ujawnia się już w okresie dzieciństwa, jak również powiązał możliwość zapobiegania rozwojowi tej choroby z jakością diety [7]. W 1908 r. po raz pierwszy w amerykańskiej literaturze pojawił się opis schorzenia zgłaszanego przez Gee [8], które nazwano schorzeniem Gee-Hertera. W kolejnych latach podjęto liczne badania wpływu na stan zdrowia ziarna różnych gatunków zbóż i skrobi w diecie pacjentów z celiakią. Wynikało z nich, że wpływ mąki pszennej był niekorzystny, podczas gdy skrobia pszenna była nieszkodliwa. Stwierdzono szkodliwe działanie nieznanej substancji wchodzącej w skład mąki, ale nie była to skrobia. Substancję, o której mowa, nazywano „czynnikiem pszenicy” [9]. Dalszy rozwój badań w zakresie choroby trzewnej nastąpił wraz z zastosowaniem metody biopsji śluzówki jelita cienkiego, co umożliwiło potwierdzenie zmian chorobowych w jelitach. W badaniach eksperymentalnych wykazano, iż to białka glutenowe odpowiedzialne są za zmiany śluzówki jelita cienkiego [10]. Błona śluzowa jelita pacjentów z enteropatią wrażliwą na gluten reagowała na prowokację glutenem in vivo ze znaczącym wzrostem syntezy IgA i IgM, który wynikał w pewnej mierze z produkcji przeciwciał antygliadynowych [11].

Obecnie celiakię definiuje się jako przewlekłą chorobę zapalną jelita cienkiego. Jest chorobą genetyczną o podłożu autoimmunologicznym. Celiakia występuje u około 1% osób w większości populacji. Najwięcej zachorowań obserwuje się u mieszkańców Europy Środkowej i Zachodniej, Skandynawii i Półwyspu Apenińskiego [2]. Wskaźnik diagnostyki wzrasta, co wydaje się spowodowane faktycznym wzrostem zachorowalności, a nie zwiększoną świadomością. Zaburzenie charakteryzuje się zróżnicowaną heterogenicznością kliniczną, która waha się od bezobjawowej do ciężko objawowej i przejawia się przy szczątkowym złym wchłanianiu, zwiększonej zachorowalności przypisywanej częstym związkom z zaburzeniami autoimmunologicznymi. Diagnoza wymaga obecności atrofii kosmków dwunastnicy, a u większości pacjentów w badaniach serologicznych stwierdza się przeciwciała przeciwko transglutaminazie tkankowej. Zrozumienie podstawy molekularnych omawianego zaburzenia umożliwiło identyfikację celów dla nowych terapii, chociaż ścisła dieta bezglutenowa pozostaje podstawą bezpiecznego i skutecznego leczenia [12, 13].

Czytaj także: Substancje intensywnie słodzące pochodzenia roślinnego − korzyści i zagrożenia