Derywatyzacja w chromatografii gazowej. Przegląd metod i reagentów

TITLE: Derivatization in gas chromatography. A review of methods and reagents

STRESZCZENIE: Synteza pochodnych (derywatyzacja) to kluczowy etap wielu metod analitycznych wykorzystujących chromatografię gazową. Pozwala na zwiększenie lotności oraz stabilności termicznej analitów, a także ułatwia identyfikację substancji. W artykule przedstawione są najważniejsze metody syntezy pochodnych oraz przegląd powszechnie stosowanych reagentów. Wskazane są także możliwe drogi rozwoju analityki w tym obszarze.

SŁOWA KLUCZOWE: chromatografia gazowa, spektrometria mas, detektory selektywne, derywatyzacja, sililowanie, alkilowanie, acylowanie

SUMMARY: Derivatization is a key stage of many analytical procedures that utilize gas chromatography as an analytical technique. It enables increasing the volatility and thermal stability of analytes, and sometimes facilitates their identification. The most important methods of derivatization and widely used reagents are described in this short review. Perspectives of the further progress in this field are also briefly discussed.

KEYWORDS: gas chromatography, mass spectrometry, selective detectors, derivatization, silylation, alkylation, acylation

W artykule przedstawione zostały najważniejsze metody syntezy pochodnych oraz przegląd powszechnie stosowanych reagentów. Wskazane są także możliwe drogi rozwoju analityki w tym obszarze.

Chromatografia gazowa (GC, gas chromatography) jest techniką szeroko stosowaną do oznaczania związków organicznych różnego typu, w tym wielu substancji naturalnych, leków czy zanieczyszczeń środowiska. Zakres przydatności chromatografii gazowej jest określany przez lotność substancji oznaczanych, ich polarność oraz stabilność termiczną [1]. Obecność grup funkcyjnych, zawierających tzw. aktywny atom wodoru (np. hydroksylowej, karboksylowej lub aminowej), powoduje radykalny wzrost temperatury wrzenia związku w porównaniu z substancjami o zbliżonej masie cząsteczkowej, które w swojej strukturze takich grup nie posiadają. Jest to spowodowane głównie zdolnością wspomnianych grup do tworzenia międzycząsteczkowych wiązań wodorowych. Obecność polarnych grup funkcyjnych powoduje także oddziaływanie substancji z materiałem, z którego wykonane są wewnętrzne ścianki kolumny, co może prowadzić do zjawiska zwanego „ogonowaniem” sygnałów (przykład na rys. 1).

Podstawowym celem syntezy pochodnych (derywatyzacji) jest zatem taka modyfikacja struktury substancji oznaczanych, by nadać im pożądane właściwości fizykochemiczne oraz zminimalizować oddziaływania o charakterze adsorpcyjnym pomiędzy cząsteczkami związków a ścianką kolumny, które zaburzają proces rozdzielania substancji w najczęściej stosowanej podziałowej chromatografii gazowej [1, 2]. Szczegółowe cele syntezy pochodnych obejmują zatem zazwyczaj:

• zwiększenie lotności w przypadku związków o wysokiej temperaturze wrzenia,
• zmniejszenie lotności w przypadku substancji bardzo lotnych,
• ograniczenie polarności związków oraz ich zdolności do tworzenia wiązań wodorowych,
• minimalizację oddziaływań o charakterze adsorpcyjnym w obrębie systemu chromatograficznego,
• zwiększenie stabilności termicznej substancji oznaczanych.

Drugim aspektem syntezy pochodnych w analizach GC jest dostosowanie właściwości związku do użytego typu detektora. Poza standardowo stosowanym detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) równie szeroko rozpowszechniony jest spektrometr mas (MS), który pozwala nie tylko na wykrycie związków, ale też ustalenie ich struktury na podstawie uzyskanych widm mas. Nieco rzadziej stosowane są detektory selektywne, jak wykrywający związki zawierające atomy fluorowców detektor wychwytu elektronów (ECD) czy detektor azotowo-fosforowy (NPD). Na potrzeby tych ostatnich stosowane bywają pochodne, zawierające atomy fluoru, chloru, azotu bądź fosforu, co pozwala uzyskać niższe niż w przypadku detektora FID granice oznaczalności i wykrywalności [1]. W przypadku połączenia chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) celem jest zwykle uzyskanie pochodnych, dających charakterystyczne widma mas. Dla powszechnie oznaczanych związków dostępne na rynku biblioteki widm mas umożliwiają zwykle identyfikację, choć nie jest to regułą dla mniej popularnych typów pochodnych [3]. Zagadnienie to zostanie omówione szerzej w kolejnym artykule.

Celem niniejszego opracowania nie jest omówienie wszystkich typów pochodnych, które do tej pory były opisane w literaturze, gdyż ich liczba jest stanowczo zbyt duża. Niniejszy artykuł ma za zadanie przybliżyć najczęściej stosowane reakcje oraz kilka przypadków mniej typowych, natomiast w kolejnym omówione zostaną szerzej wybrane procedury oraz metody oceny ich skuteczności w analizach rzeczywistych.

Podstawowe typy pochodnych w analizie GC

Najbardziej rozpowszechnione typy reakcji derywatyzacji, stosowanych na potrzeby analiz GC, to procesy sililowania, alkilowania i esteryfikacji oraz acylowania [1, 2]. Spośród wyżej wymienionych najbardziej uniwersalne i najczęściej stosowane są pochodne sililowe. Jest tak do tego stopnia, że nieraz opis postępów w opracowywaniu nowych metod derywatyzacji obejmuje wszystkie reakcje poza syntezą pochodnych sililowych [4]. Oprócz wymienionych trzech podstawowych grup reakcji istnieje wiele bardziej wyspecjalizowanych procedur, przydatnych np. w lokalizacji wiązań podwójnych czy identyfikacji związków zawierających inne charakterystyczne elementy strukturalne [5]. Reakcje te w większości nie będą tu omówione. Aldehydy i ketony przekształca się zazwyczaj w odpowiednie oksymy przy użyciu hydroksyloaminy. Przegląd najpowszechniej stosowanych pochodnych według podziału na wybrane grupy funkcyjne został przedstawiony w tab. 1.

Pochodne sililowe

Odczynniki stosowane w procedurach syntezy pochodnych sililowych zastępują aktywny atom wodoru grup hydroksylowych, karboksylowych, tiolowych oraz aminowych ugrupowaniami trimetylosililowymi (TMSi), tert-butylodimetylosililowymi (TBDMSi) lub – stosunkowo najrzadziej – chlorometylodimetylosililowymi, choć możliwości jest znacznie więcej [1, 2, 6]. Alkohole, fenole i kwasy karboksylowe ulegają reakcji łatwiej niż aminy. W przypadku grup hydroksylowych i aminowych o wyższej rzędowości, derywatyzacja może być utrudniona lub – w niektórych przypadkach – wręcz niemożliwa ze względu na zbyt dużą zawadę steryczną. Szczególnie trudne reakcje prowadzi się w wysokich temperaturach, często przy użyciu mieszaniny kilku substancji sililujących, czego przykłady pojawią się w kolejnym artykule. Przegląd najpopularniejszych odczynników, ich struktur i nazw znajduje się na rys. 2.

W przypadku powszechnie stosowanych do syntezy pochodnych TMSi oraz TBDMSi odczynników: N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) oraz N-metylo-N-(tert-butylodimetylosililo)trifluoroacetamidu (MTBSTFA), jako katalizatory stosuje się często odpowiednio trimetylochlorosilan (TMCS) oraz tert-butylodimetylochlorosilan (TBDMCS). Reakcję prowadzi się zazwyczaj w podwyższonej temperaturze (60-120°C) przez określony czas – przegląd procedur zostanie przedstawiony w kolejnym artykule.

Wybór rodzaju pochodnych sililowych, odpowiednich do analizy poszczególnych substancji, nie jest oczywisty. Najczęściej stosowane pochodne TMSi są bardziej lotne niż odpowiednie pochodne TBDMSi, a odczynniki do ich syntezy znacznie lepiej radzą sobie z derywatyzacją grup funkcyjnych, w przypadku których występuje znaczna zawada steryczna [7]. Nie jest to zaskoczeniem, jeśli weźmiemy pod uwagę rozmiar grupy tert-butylodimetylosililowej. Z drugiej strony, w przypadku niektórych związków, pochodne TBDMSi dają znacznie bardziej charakterystyczne widma mas, co ułatwia ich identyfikację. Wadą procedury trimetylosililowania jest także znaczne ryzyko powstawania artefaktów – niepożądanych pochodnych o innej niż spodziewana strukturze chemicznej [8]. Co więcej, pochodne TMSi są znacznie mniej stabilne niż odpowiednie pochodne TBDMSi; w przypadku niektórych substancji rozpad pochodnych następuje w ciągu kilku do kilkudziesięciu godzin. Jest to zależne od temperatury przechowywania próbek: niskie temperatury (od -20°C do 4°C) sprzyjają dłuższej trwałości [9]. Pod uwagę brać też trzeba dostęp tlenu z atmosfery, a także strukturę substancji. Obserwacje autora niniejszej pracy sugerują, że estry sililowe są bardziej podatne na szybki i spontaniczny rozpad niż etery sililowe. Zarówno pochodne TMSi, jak i TBDMSi, są podatne na rozpad pod wpływem wody oraz niższych alkoholi (metanol, etanol), stąd ich obecność w środowisku reakcji jest wykluczona.

Estryfikacja i alkilowanie

Synteza estrów kwasów karboksylowych jest prawdopodobnie drugą, po sililowaniu, najczęściej stosowaną metodą uzyskiwania pochodnych na potrzeby analiz techniką GC. Spośród wszystkich dostępnych rodzajów estrów najchętniej syntezowane są estry metylowe, a metod ich uzyskiwania jest wiele [10-12]. Klasyczne procedury uwzględniają np. zastosowanie metanolowych roztworów kwasów (HCl, H₂SO₄), roztworu trifluorku boru w metanolu czy metanolanu sodu. Prawdopodobnie najszybszą i najbardziej skuteczną metodą syntezy jest użycie roztworu diazometanu w eterze dietylowym, jednak gaz ten jest niestabilny i toksyczny, a procedura jego uzyskania w laboratorium – stosunkowo niebezpieczna. Z tego względu w ostatnich latach chętnie stosuje się jego bezpieczny, stabilny zamiennik, jakim jest trimetylosililodiazometan (TMSD), dostępny handlowo w formie roztworów w metanolu lub n-heksanie [12, 13]. Choć niektórzy autorzy sugerują możliwość powstawania artefaktów oraz – co jest uzasadnione mechanizmem reakcji – niekompletną estryfikację badanych związków [13], przy zachowaniu odpowiedniego środowiska reakcji (obecność metanolu oraz niepolarnego rozpuszczalnika) wyniki mogą być zadowalające, a sama metoda konkurencyjna dla klasycznych sposobów uzyskiwania estrów metylowych. Choć oryginalnie TMSD był stosowany do syntezy estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), znalazł zastosowanie także w uzyskiwaniu pochodnych śladowych ilości substancji z grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych [14]. Inne rodzaje estrów kwasów karboksylowych są stosowane rzadziej – niektóre przypadki zostaną omówione pokrótce w ostatnim fragmencie tej pracy oraz w kolejnym artykule.

Alkilowe pochodne związków innych niż kwasy karboksylowe, nie są syntezowane rutynowo i mają zastosowanie tylko w szczególnych przypadkach. Etery metylowe fenoli można syntezować przy pomocy wielu odczynników, które estryfikują kwasy tłuszczowe. Jako bezpieczny zamiennik diazometanu także i w tym przypadku można zastosować TMSD w obecności diizopropyloetyloaminy [15].

Czytaj także: Oznaczanie węglowodanów w produktach spożywczych techniką chromatografii jonowej