Bakterie lubiące zimno i chłód – jak je izolować, hodować i identyfikować

Psychrofile, aby przetrwać, musiały wykształcić zmiany w białkach i lipidach komórkowych pozwalające na adaptację do wzrostu w niskich temperaturach.

TITLE: Cold- and chill-loving bacteria – how to isolate, grow and identify them

STRESZCZENIE: Bakterie żyjące na obszarach, gdzie przeważa niska temperatura, są ciągle słabo poznane. Wynika to z trudności w odwzorowaniu naturalnych warunków życia bakterii w laboratorium oraz niewystarczająco rozwiniętych technik badawczych. Sytuacja ta jednak stopniowo się zmienia, wraz z coraz większym zainteresowaniem i wykorzystywaniem szczepów psychrofilnych w procesach biotechnologicznych oraz ciągłym rozwojem znanych, jak i nowych technik genetycznych oraz metagenomicznych.

SŁOWA KLUCZOWE: psychrofile, psychrotorfy, techniki identyfikacyjne

SUMMARY: Bacteria living in areas where low temperature prevails are still poorly understood. This is due to the difficulty in recreation of the natural living conditions of bacteria in a laboratory and insufficiently developed research techniques. However, this situation is gradually changing with the growing interest and use of psychrophilic strains in biotechnological processes and the continuous development of known and new genetic and metagenomic techniques.

KEYWORDS: psychrophiles, psychrotorphs, identification techniques

Bakterie, dzięki swym zdolnościom do adaptacji, można znaleźć w najbardziej ekstremalnych środowiskach na Ziemi. Takie bakterie nazywamy ekstremofilami. Wykazują one zdolność do wzrostu w niesprzyjających warunkach środowiska, jak: wysokie zasolenie, wysokie ciśnienie, niewystarczająca ilość wody, wysokie dawki promieniowania, niskie lub wysokie zakresy pH, a także wysoka lub niska temperatura [1, 2]. Temperatura to jeden z najistotniejszych parametrów regulowania wzrostu drobnoustrojów w naturalnym środowisku, a fakt opanowania przez mikroorganizmy różnorodnych środowisk sugeruje istotną rolę adaptacji [3, 4]. Drobnoustroje zdolne do wzrostu w temperaturze poniżej 15°C nazywamy psychrofilami. Są one jednymi z bardziej rozpowszechnionych organizmów na naszej planecie, gdyż ok. 75% środowisk Ziemi zajmuje psychrosfera, czyli zimne obszary, w których temperatura nie przekracza 5°C. Temperatura 90% objętości oceanów wynosi 5°C lub mniej. Takie temperatury niezmiennie panują również na wysokości powyżej 3000 m n.p.m. Psychrofile można spotkać pod wielometrową warstwą lodu, w subglacjalnych osadach i lodzie [5], w wyższych warstwach atmosfery, gdzie temperatury spadają nawet do -40°C, w wieloletniej zmarzlinie, czyli permafroście, gdzie ziemia pozostaje zamarznięta przez co najmniej dwa lata, choć w praktyce okres ten trwa zwykle znacznie dłużej. Drobnoustroje psychrofilne wzrastają również na mrożonej żywności, stąd nie jest zalecane przechowywanie produktów w temperaturze powyżej -10°C [6, 7].

Charakterystyka psychrofili

Pierwszymi wyizolowanymi drobnoustrojami psychrofilnymi były bioluminescencyjne bakterie otrzymane z ryb, które przechowywano w niskiej temperaturze. Bakterie te w 1887 roku wyizolował Foster, który zauważył, że wykazują wzrost w temperaturze 0°C. Do momentu opublikowania pracy przez Morita w 1975 roku nie istniały ustalone kryteria podziału i wyodrębniania psychrofili [8]. W pracy tej zaproponowano, że psychrofile to organizmy, dla których optimum wzrostu to mniej niż 15°C, przy czym maksymalna temperatura wynosi poniżej 20°C. Z kolei psychrotrofy, pomimo zdolności do namnażania się w temperaturze nawet 0°C, optimum wykazują powyżej 15°C, a za ich maksimum wzrostu przyjmuje się temperaturę powyżej 20°C, choć może ona w niektórych przypadkach wynosić nawet 40°C. Psychrotrofy są szeroko spotykane w środowiskach ulegających wahaniom temperatur, natomiast psychrofile są ograniczone do siedlisk o stale niskich temperaturach [4, 9].

Mikroorganizmy są pozbawione mechanizmów termoregulacji, stąd ich wrażliwość na wahania temperatury. Zarówno temperatury zbyt wysokie, jak i zbyt niskie od optimum wzrostu danego organizmu powodują zaburzenie aktywności oraz uszkodzenie struktur. W temperaturach powyżej maksimum wzrostu spada zdolność pobierania tlenu, temperatury poniżej minimum wzrostu grożą m.in. usztywnieniem błony komórkowej czy spowolnieniem reakcji enzymatycznej, a także mechanicznymi uszkodzeniami spowodowanymi przez powstające kryształki lodu [10, 11]. Dlatego też aby przetrwać, psychrofile musiały wykształcić zmiany w białkach i lipidach komórkowych pozwalające na adaptację do wzrostu w niskich temperaturach [2, 12]. Błona komórkowa komórki prokariotycznej, podobnie jak ta występująca u organizmów wyższych, zbudowana jest z dwuwarstwy fosfolipidowej. Do jej prawidłowego funkcjonowania musi znajdować się w fazie ciekłokrystalicznej, a niskie temperatury mają niekorzystny wpływ na jej funkcje i właściwości fizyczne. Prowadzą do coraz mniejszej płynności i przejścia błony w stan żelu, przez co zostaje zakłócony transport cząsteczek poprzez błonę cytoplazmatyczną [13]. Psychrofile musiały wykształcić mechanizmy pozwalające na przeciwdziałanie zjawisku utraty płynności błony cytoplazmatycznej. Dlatego też w niskich temperaturach zauważalny jest wzrost nienasyconych i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Powoduje to rozluźnienie membrany, przez co jest ona bardziej płynna. Do tego niezwykle korzystne jest występowanie wiązań w pozycji cis, przez co cząsteczka kwasu przybiera kształt litery V, powodując rozluźnienie upakowania [14, 15]. Kolejną korzystną modyfikacją jest skrócenie łańcucha tłuszczowego, przez co zmniejsza się ilość występujących interakcji węgiel – węgiel między łańcuchami, dzięki czemu zostaje obniżona temperatura topnienia [13]. Na zwiększenie płynności błony korzystnie wpływa również wzrost występowania rozgałęzionych kwasów tłuszczowych [16, 17]. Mniej powszechne strategie to zwiększenie ilości białka w dwuwarstwie fosfolipidowej, większa ilość dużych głów w lipidach czy niepolarnych pigmentów karotenoidowych [18]. Wszystkie te strategie pomagają utrzymać płynność błony i jej funkcjonowanie w niższej temperaturze [13]. Jednym z ważniejszych przystosowań jest adaptacja enzymów, gdyż wraz ze spadkiem temperatury spada szybkość reakcji chemicznych. Muszą one ulec modyfikacji umożliwiającej zachowanie aktywności w temperaturze około 0°C. Psychrofilne enzymy wykazują tendencję ku zmniejszaniu energii aktywacji, czego skutkiem jest zwiększona wydajność katalityczna, co prawdopodobnie związane jest ze zwiększeniem plastyczności obszaru miejsca aktywnego w porównaniu do enzymów bakterii mezofilnych [12, 19]. Zwiększona plastyczność struktury białka, głównie regionu katalitycznego, uzyskana jest m.in. przez: zredukowanie liczby par jonowych, oddziaływań hydrofobowych, wiązań wodorowych, zmniejszenie interakcji pomiędzy podjednostkami białkowymi [14]. Zmiany te skutkują zmniejszeniem energii aktywacji i zwiększeniem wydajności katalitycznej. Możliwe, że miejscowe zwiększenie giętkości, pozytywnie wpływające na wydajność katalityczną, jest przyczyną mniejszej stabilności psychrofilnych białek [20]. Ponadto psychrofile wytwarzają specyficzne białka umożliwiające im adaptację. W odpowiedzi na narażenie na zbyt niską dla danego organizmu temperaturę, syntetyzowane są białka szoku zimna Csp (ang. cold shock proteins). Białka te u bakterii bytujących w zawsze zimnych środowiskach syntetyzowane są w sposób ciągły [17]. Można je podzielić na dwie grupy: białka produkowane natychmiast po spadku temperatury, których obecność w komórce trwa krówko oraz tzw. białka Cap (ang. cold acclimation proteins) będące produkowane z pewnym opóźnieniem, lecz długotrwale [21]. Funkcja białek Csp polega na przyłączaniu się do rybosomów, które to na skutek zbyt niskiej temperatury przeszły w tzw. stan nietranslacyjny, związany z nieprawidłowym zwijaniem się RNA, dzięki czemu naprawiają te nieprawidłowości. Biorą one również udział w naprawie DNA, gdyż do białek tych zalicza się m.in.: czynnik rekombinacji RecA, podjednostkę alfa gyrazy GyrA czy czynnik transkrypcyjny. Kolejne białka pełniące funkcje ochronne to białka nukleacyjne lodu (ang. ice nuclearing proteins). Nukleacja jest procesem zapoczątkowania fazowej przemiany jakiejś substancji, tutaj jest to przemiana wody w lód lub odwrotnie. Białka nukleacyjne zlokalizowane są na błonie zewnętrznej drobnoustroju, gdzie do ich powierzchni adsorbują się cząsteczki wody, tworząc kryształy lodu, które nie zagrażają komórce ze względu na ich zbyt dużą wielkość, aby dostać do jej wnętrza. Białka te mogą również hamować powstawanie kryształków lodu [22, 23]. Ostatnimi białkami spotykanymi u niektórych psychrofilnych bakterii są białka termicznej histerezy THP (ang. thermal hysteresis proteins) powodujące obniżenie temperatury krzepnięcia wody. Białka te nazywane bywają również białkami przeciwzamarzaniowymi AFP (ang. antifreeze proteins) [24].

Hodowla drobnoustrojów psychrofilnych

W porównaniu chociażby do środowiskowych bakterii mezofilnych, liczba zidentyfikowanych bakterii wzrastających w niskich temperaturach jest niewielka. Związane jest to z utrudnieniami, jakich nastręcza hodowla tych mikroorganizmów i trudnościami w doborze metod badawczych. Brak jest protokołów określających warunki hodowli i identyfikacji drobnoustrojów psychrofilnych. W literaturze można spotkać dane mówiące o tym, że dla wolno rosnących drobnoustrojów najczęściej wykorzystuje się podłoże R2A promujące wzrost drobnoustrojów charakteryzujących się wolniejszym wzrostem, odpornością na stres i o małych wymaganiach odżywczych. Hodowlę prowadzić można również m.in. na podłożach ogólnych do szerokiego stosowania [25]. Poważnym utrudnieniem w hodowli jest wydłużony czas generacji zimnolubnych bakterii spowodowany spowolnieniem procesów metabolicznych. Podczas gdy do widocznego wzrostu środowiskowych bakterii strefy umiarkowanych temperatur czy izolatów pochodzenia klinicznego wystarczający czas zazwyczaj wynosi 24-48 godzin, to w przypadku psychrofili czas ten może wynosić nawet kilka tygodni. Pochodząca z arktycznego lodu morskiego bakteria Psychromonas ingrahami, wykazująca aktywność w temperaturze do -12°C, posiada czas generacji wynoszący aż 240 godzin [26]. W przypadku izolacji, przed użyciem podłoża hodowlane powinny być przechowywane w lodówce oraz należy unikać ekspozycji psychrofili na temperatury wyższe niż 25°C, aby zapobiec utracie żywotności [27]. Wykazano, że początkowa inkubacja w płynnej pożywce w temperaturze 0-2°C pozytywnie wpływa na zwiększenie izolacji bakterii psychrofilnych. Hodowla powinna trwać 24-48 godzin, po czym próbkę należy wysiać na świeże podłoże [8]. Wyizolowane bakterie należałoby przesiać ponownie i równocześnie hodować w temperaturze ok. 4°C i 20°C, aby sprawdzić, czy otrzymane szczepy to bakterie psychrofilne, czy psychrotroficzne. Psychrofile wzrosną jedynie w niższej temperaturze, a psychrotrofy w obu. Po wyizolowaniu i namnożeniu bakterii możliwe jest ich przechowywanie w temperaturze 1-2°C na podłożu z dodatkiem cykloheksamidu, aby nie doszło do kontaminacji grzybami. Należy zachować ostrożność, aby nie doszło do zamarzania mediów, co mogłoby spowodować uszkodzenie komórek. Większość psychrofili powinna być pasażowana co 4 do 6 miesięcy. W celu dłuższego przechowywania zaleca się umieścić bakterie w podłożu z dodatkiem glicerolu i umieścić początkowo w -20°C, a następnie w -70°C/-80°C [27].

Metody identyfikacji

Psychrofile, jak i inne mikroorganizmy, można identyfikować, wykorzystując metody fenotypowe i molekularne. Podstawowe metody wstępnej identyfikacji wykorzystują: ocenę morfologii kolonii bakteryjnej oraz poszczególnych komórek, wytwarzanie pigmentów, barwienie metodą Grama czy przeprowadzanie testów biochemicznych. Liczba metod stosowanych do identyfikacji mikroorganizmów jest bardzo duża, dlatego przytoczone zostaną tylko niektóre z nich. Metody biochemiczne, jak: wykorzystywane źródło węgla, utlenianie i fermentacja węglowodanów, profil enzymatyczny. Metody chemotaksonomii obejmujące m.in.: analizę kwasów tłuszczowych, fosfolipidów, aminokwasów i cukrów ściany komórkowej [28]. Metody te jednak najczęściej bywają niewystarczające do identyfikacji mało poznanych bakterii preferujących niskie temperatury wzrostu.

Czytaj także: Nowoczesna metoda identyfikacji mikroorganizmów