Zastosowanie technik sprzężonych w analizie specjacyjnej selenu w napojach roślinnych

TITLE: Application of hyphenated techniques in the speciation analysis of selenium in plant-based beverages

STRESZCZENIE: Selen to pierwiastek należący do mikroelementów niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Występuje w aminokwasach, które stanowią składową wielu kluczowych enzymów. Selen występuje zarówno w produktach pochodzenia roślinnego, jak i zwierzęcego, w formie nieorganicznej oraz organicznej. Rośliny mogą przyswajać selen z gleby, wody i atmosfery, do tego potrafią go przekształcać i metabolizować.

Obecnie informacja o całkowitym stężeniu pierwiastka jest niewystarczająca, ponieważ na jego przyswajalność z pokarmów ma wpływ jego forma chemiczna. W celu poznania form selenu przeprowadza się analizę specjacyjną, która dostarcza niezbędnych informacji na ten temat. Aby poprawić jakość oznaczeń i identyfikację nieznanych form związków w analizie specjacyjnej, stosowane są techniki sprzężone, łączące wysokosprawne techniki rozdzielania ze specyficznymi technikami detekcji. Do rozdzielania form selenu są najczęściej stosowane techniki chromatograficzne, natomiast do identyfikacji nieznanych form wykorzystywana jest spektrometria mas.

Zastosowanie techniki chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie pozwoliło na rozdzielenie oraz identyfikację związków selenu w wybranych napojach roślinnych. Zoptymalizowana metoda pozwoliła na identyfikację metyloselenocysteiny w napoju sojowym, a w napoju jaglanym zidentyfikowano γ-glutamylo-selenocystationinę.

SŁOWA KLUCZOWE: selen, analiza specjacyjna, napoje roślinne, techniki sprzężone

SUMMARY: Selenium is an element belonging to micronutrients that are necessary for the proper functioning of the body. It is present in amino acids, which build several vital enzymes. Selenium can be found in animal- and plant-based products, in both organic and inorganic forms. Plants can assimilate selenium from soil, water, and the atmosphere and then transform it and metabolise.

Since the bioavailability of the element from food is affected by its chemical form, the information on its total concentration alone is insufficient. In order to identify the selenium species, speciation analysis is used to provide the necessary information. Hyphenated techniques, which combine high-performance separation techniques with specific detection techniques, are used in speciation analysis to improve the quality of determination and identification of unknown species. Chromatographic techniques are most commonly used to separate selenium forms, while mass spectrometry is used for their identification.

The application of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry with electrospray ionisation allowed to separate and identify selenium compounds in selected plant-based beverages. The optimised method enabled the identification of methylselenocysteine and glutamyl-selenocystationine in soy and millet beverages, respectively.

KEYWORDS: selenium, speciation analysis, plant-based beverages, hyphenated techniques

Techniki sprzężone wykorzystywane do przeprowadzania analizy specjacyjnej pozwalają na znalezienie odpowiedzi, w jakiej formie badany analit znajduje się w analizowanym materiale.

Selen to pierwiastek należący do mikroelementów niezbędnych do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania organizmu człowieka. Pierwiastek ten występuje m.in. w postaci selenoaminokwasów: selenometioniny oraz selenocysteiny, które wchodzą w skład kluczowych enzymów, np. peroksydazy glutationowej, reduktazy tioredoksyny czy dejodynazy jodotyroninowej. Peroksydaza glutationowa i reduktaza tioredoksyny stanowią ochronę dla komórek przed szkodliwym wpływem wolnych rodników powstających podczas procesów utleniania. Enzym dejodynaza jodotyroninowa bierze udział w prawidłowym funkcjonowaniu hormonów tarczycy. Do prawidłowego funkcjonowaniu organizmu kluczowa jest właściwa suplementacja tego pierwiastka, ponieważ istnieje bardzo mała różnica pomiędzy niezbędnym stężeniem selenu a jego toksyczną zawartością. Dodatkowo ważna jest informacja o formie selenu występującej w pożywieniu, ponieważ od tego zależy możliwość przyswajania mikroelementów przez organizm ludzki [1, 2].

Selen występuje zarówno w produktach pochodzenia roślinnego, jak i zwierzęcego. Jego zawartość w produktach roślinnych zależy od obszaru geograficznego i gleby, na której były one uprawiane [3]. Rośliny mogą przyswajać selen z gleby, wody i atmosfery, do tego potrafią go przekształcać i metabolizować. Na akumulację selenu przez rośliny ma wpływ wiele czynników. Przede wszystkim ważne są jego stężenie i formy fizykochemiczne, a także obecność innych związków organicznych i nieorganicznych, jak również poziom wilgotności i zasolenia gleby. W przypadku roślin ważną rolę odgrywa również kwasowość podłoża, na którym są uprawiane. W glebach kwaśnych, w których selen występuje najczęściej w postaci SeO₃^2-, jest on trudniej przyswajany ze względu na niską rozpuszczalność i dostępność dla roślin. Inaczej jest w glebach zasadowych, w których jest utleniany i obecny w formie SeO₄^2-. Seleniany są lepiej rozpuszczalne i łatwiejsze do pobrania przez rośliny [3].

W roślinach selen może być metabolizowany na wiele sposobów. Po wchłonięciu do tkanek roślinnych bywa niespecyficznie włączany do selenoaminokwasów oraz białek lub przekształcany do lotnych związków (np. dimetyloselenku), które następnie mogą być uwolnione do atmosfery z zewnętrznych powierzchni. Selen jest transportowany z korzeni do liści za pomocą ksylemu, nie ulegając przemianom chemicznych. Następnie w chloroplastach liści ulega redukcji do selenku w wyniku serii enzymatycznych i nieenzymatycznych reakcji. Powstały selenek może być z kolei przekształcony do selenocysteiny poprzez połączenie z o-acetyloseryną. W dalszej kolejności selenocysteina może być metabolizowana do selenometioniny [4].

Selen w roślinach występuje zarówno w formie nieorganicznej, jak i organicznej. W formie organicznej pierwiastek ten jest obecny w postaci selenoaminokwasów, selenoprotein i selenopeptydów. W materiałach roślinnych zostały zidentyfikowane takie formy selenu jak: selenometionina (SeMet), selenocysteina (SeCys), selenometylocysteina (MeSeCys), selenocystyna (SeCys₂), γ-glutamylo-metyloselenocysteina (γ-glu-MeSeCys) i selenolantionina (SeLan) [5].

Dodatkowo niektóre źródła podają informację o występowaniu w roślinach akumulujących selen takich form specjacyjnych, jak: γ-glutamylo-selenocystationina, selenocystationina, selenometylometionina i selenohomocysteina [6, 7].

Obecnie informacja o całkowitej zawartości danego pierwiastka jest niewystarczająca. Biodostępność, toksyczność i akumulacja pierwiastków w dużej mierze zależą od formy pierwiastka, w jakiej występuje. Zatem wiedza na temat poszczególnych form selenu i jego przemian jest niezwykle istotna. Takich informacji dostarczają specjacja i analiza specjacyjna pierwiastków, które pozwalają na zrozumienie procesów związanych z obiegiem danego pierwiastka w przyrodzie i jego przemian [18].

Pojęciem „specjacja” można określić występowanie różnych form fizycznych i chemicznych tego samego pierwiastka. Z kolei analiza specjacyjna wiąże się z identyfikacją i oznaczaniem tych form w danej próbce za pomocą różnych metod analitycznych [20]. Analiza specjacyjna przysparza niekiedy wielu problemów, po pierwsze, kluczową trudnością jest fakt, że poszczególne formy pierwiastka występują w bardzo małych zawartościach, wręcz śladowych. Kolejnym problemem jest etap wydzielania form pierwiastka z materiału. Podczas niego możliwe są przemiany form specjacyjnych, które mogą ulegać różnym niekontrolowanym przemianom chemicznym, fotochemicznym, enzymatycznym czy mikrobiologicznym [21].

Podstawową kwestią podczas analizy specjacyjnej selenu jest dobór odpowiedniej metody pomiarowej, w tym techniki analitycznej. Dobra metoda analityczna powinna charakteryzować się selektywnością, dzięki której oznaczenie substancji w obecności innych składników w próbce nie będzie stanowiło problemu. Dodatkowo powinna cechować się wystarczającą granicą wykrywalności i oznaczalności, aby można było wykryć śladowe ilości pierwiastka. Ważne są także precyzja, poprawność i dokładność wybranej metody. Cechą braną pod uwagę podczas wyboru metody pomiarowej jest także czas wykonywania analizy i koszt aparatury pomiarowej [7].

Technikami najczęściej stosowanymi do rozdzielania form selenu są chromatografia cieczowa (HPLC) i chromatografia gazowa (GC). Inną możliwą techniką rozdzielania form selenu jest elektroforeza kapilarna (CE), która charakteryzuje się wyższą wydajnością w porównaniu do chromatografii. Dodatkowo w elektroforezie kapilarnej wykorzystuje się małe objętości próbek (rzędu nL), zatem wiąże się to z minimalnym zużyciem odczynników. Natomiast do ich identyfikacji jako detektory używane są: atomowa spektrometria fluorescencyjna (AFS), atomowa spektrometria absorpcyjna (AAS), optyczna spektrometria atomowa z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES), a także spektrometria mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS) lub cząsteczkowa spektrometria mas z jonizacją poprzez elektrorozpraszanie (ESI-MS) [22].

Innymi technikami stosowanymi w analizie specjacyjnej selenu są techniki aktywacji neutronowej (NAA) i pulsowa różnicowa katodowa woltamperometria inwersyjna (strippingowa) (DPCSV) [18, 23, 24].

Czytaj także: Kofeina w energetykach dostępnych na polskim rynku