Rola błonowego białka TolC w biologii bakterii

Transportery RND mogą być kodowane na chromosomie, jak jest to w przypadku systemu AcrB w rodzinie Enterobacteriaceae. Dodatkowo charakteryzują się najszerszym spektrum substratowym, przez co określa się, że to właśnie ta klasa pomp efflux pełni najważniejszą rolę w oporności bakterii na środki przeciwbakteryjne [31, 32]. Jest to liczna grupa transporterów, natomiast te posiadające zdolność do współpracy z kanałem TolC najczęściej identyfikowane są u E. coli oraz innych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae [10, 31, 33]. Przykładowe systemy wyrzutu leków RND wraz z zakresem substratowym zostały przedstawione w tab. 1.

Pomimo dużej różnorodności systemów transportowych mogących występować u E. coli, to właśnie kompleks AcrAB-TolC pełni główną rolę w wyrzucie szkodliwych substancji, a nadekspresja innych systemów z tej klasy, jak AcrEF-TolC, zachodzi dopiero gdy AcrAB-TolC ulega inaktywacji [10, 33, 37]. Jest to system dobrze poznany pod względem budowy, dodatkowo jest bliskim homologiem innych transporterów zaliczanych do rodziny RND. W związku z czym ogólna budowa oraz mechanizm działania tych pomp są do siebie zbliżone [4, 33, 37]. Proksymalny element tego kompleksu, czyli białko AcrB, zakotwiczone jest w wewnętrznej błonie cytoplazmatycznej. Pełni kluczową rolę w funkcjonowaniu pompy, ponieważ, jak zostało wcześniej wspomniane, element ten odpowiada za rozpoznawanie i wiązanie substratu przeznaczonego do wyrzutu, a także za proces antyportu substrat-proton, który stanowi siłę napędową transportera [32]. Proces ten zachodzi swoiście dla każdego rodzaju substancji, ponieważ rozpoznawane antybiotyki wiążą się z innymi resztami aminokwasowymi [1, 15].

W obrębie podjednostki AcrB wyróżnić można cztery elementy: trzy monomery (każdy zbudowany z dwunastu α-helis umiejscowionych w błonie cytoplazmatycznej) oraz domenę znajdującą się w obszarze peryplazmy, która określana bywa hełmem (ang. headpiece) (ryc. 3) [3, 15, 17]. Zadaniem tego ostatniego elementu jest utworzenie funkcjonalnego kanału, który kontaktować ma się z OMP. W obrębie hełmu znajduje się również miejsce aktywne, gdzie rozpoznawane są substraty pompy. Dookoła miejsca aktywnego znajdują się trzy przedsionki, które pełnią ważną rolę, ponieważ to dzięki nim możliwe jest zbieranie szkodliwych substancji z przestrzeni peryplazmatycznej. Po związaniu odpowiedniego substratu jest on aktywnie transportowany najpierw kanałem peryplazmatycznym w obrębie hełmu, a następnie kanałem utworzonym przez białko TolC [15]. Chociaż istnieją badania sugerujące kontakt wszystkich podjednostek transportera, to analizy z użyciem mikroskopii elektronowej sugerują, że białka AcrB oraz TolC nie wchodzą w bezpośredni kontakt ze sobą. Natomiast ostatni element, czyli podjednostka AcrA, a dokładnie sześć białek AcrA rozmieszczonych dookoła pompy w obszarze peryplazmy, odpowiadają za łączenie obu podjednostek transportera i zapewniają jego szczelność [17, 40]. Dodatkowo, AcrA pośredniczy w przekazywaniu energii zapewnionej przez transporter AcrB do kanału TolC, co jest niezbędne do zmiany konformacji i otwarcia tego ostatniego elementu podczas wyrzutu substancji [14, 17]. Wspomniany wcześniej system AcrEF-TolC staje się głównym mechanizmem oporności wielolekowej po wcześniejszej inaktywacji wysoce homologicznej pompy AcrAB-TolC [41]. Transporter AcEF-TolC wówczas pełni główną rolę w oporności szczepów E. coli na szereg antybiotyków, szczególnie fluorochinolonów [42].

Podsumowanie

Białko TolC jako składnik błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych współtworzy systemy wyrzutu dla leków zaliczane do trzech klas: RND, ABC i MFS. Poprzez swoją lokalizację w osłonach komórkowych umożliwia transport szkodliwych substancji bezpośrednio do otoczenia komórki, a nie do przestrzeni peryplazmatycznej, jak to jest w systemach jednoskładnikowych [4, 28, 30]. Pompy posiadające w swojej strukturze kanał utworzony przez TolC są zaangażowane w transport różnych cząsteczek, takich jak siderofory, witaminy, białka i kwasy tłuszczowe, które są niezbędne w procesach metabolicznych bakterii [1, 18, 25, 34, 35, 36, 37, 38, 39]. Ponadto, białko to uczestniczy w tworzeniu biofilmu oraz bierze udział w odpowiedzi komórki na stres osmotyczny. Udział omawianego białka w fizjologii bakterii oraz w determinowaniu oporności na leki jest przykładem wykorzystania przez drobnoustroje TolC jako narzędzia wielofunkcyjnego, warunkującego przetrwanie w zmiennych warunkach.

Projekt badawczy finansowany ze środków programu „Inicjatywa Doskonałości – Uczelnia Badawcza (IDUB) na lata 2020-2026 dla Uniwersytetu Wrocławskiego”.

Piśmiennictwo

1. Jarmuła A. i wsp.: Efflux-mediated antimicrobial multidrug resistance. „Post. Hig. Med. Dośw.”, 2011,  65, 216–27.
2. Chitsaz M. i Brown M.H.: The role played by drug efflux pumps in bacterial multidrug resistance. „Essays Biochem.”, 2017, 61 (1), 127–139.
3. Krysta K., Sulowicz S. i Piotrowska-Seget Z.: Białkowe systemy eksportu warunkujące oporność bakterii na antybiotyki. „Post. Biol. Komórki”, 2011, 38 (2), 297–312.
4. Puzari M. i Chetia P.: RND efflux pump mediated antibiotic resistance in Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa: a major issue worldwide. „World J Microbiol Biotechnol”, 2017, 33 (24).
5. Alnaseri H. i wsp.: Inducible Expression of a Resistance-Nodulation-Division-Type Efflux Pump in Staphylococcus aureus Provides Resistance to Linoleic and Arachidonic Acids. „J Bacteriol.”, 2014, 197 (11), 1893–1905.
6. Schindler B.D. i wsp.: Analyses of Multidrug Efflux Pump-Like Proteins Encoded on the Staphylococcus aureus Chromosome. „Antimicrob Agents Chemother.”, 2015, 59 (1), 747–748.
7. 7. Yang L. i wsp.: RND transporters protect Corynebacterium glutamicum from antibiotics by assembling the outer membrane. „Microbiologyopen”, 2014, 3 (4), 484–496.
8. Zgurskaya H.I. i wsp.: Mechanism of coupling drug transport reactions located in two different membranes. „Front. Microbiol”, 2015, 6, 100.
9. Futoma-Kołoch B. i wsp.: Outer membrane proteins of Salmonella as potential markers of resistance to serum, antibiotics and biocides. „Curr. Med. Chem.”, 2019, 26 (11), 1960–1978.
10. Wasążnik A., Grinholc M. i Bielawski K.P.” Czynne usuwanie leku z komórki jako jeden z mechanizmów oporności bakterii na środki przeciwdrobnoustrojowe i metody jego zwalczania. „Post. Hig. Med. Dośw.”, 2009, 63, 123–133.
11. Schindler B.D. i Kaatz G.W.: Multidrug efflux pumps of Gram-positive bacteria. „Drug Resist. Updat.”, 2016, 27, 1–13.
12. Srinivasan V.B. i Rajamohan G.: KpnEF, a new member of the Klebsiella pneumoniae cell envelope stress response regulon, is an SMR-type efflux pump involved in broad-spectrum antimicrobial resistance. „Antimicrob. Agents Chemother”, 2013, 57 (9), 4449–4462.
13. Tal N. i Schuldiner S.: A coordinated network of transporters with overlapping specificities provides a robust survival strategy. „Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.”, 2009, 106 (22), 9051–9056.
14. Pattanayak B.S. i wsp.: Kanamycin-Mediated Conformational Dynamics of Escherichia coli Outer Membrane Protein TolC. „Front. Mol. Biosci.”, 2021, 8, 636286.
15. Pos K.M.: Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump. „Biochim. Biophys. Acta.”, 2009, 1794 (5), 782–793.
16. Baj J., Markiewicz Z.: Biologia molekularna bakterii. „Wydawnictwo Naukowe PWN”, 2015; 33-81.
17. Wang Z. i wsp.: An allosteric transport mechanism for the AcrAB-TolC multidrug efflux pump. „eLife”, 2017, 6, 1–19.
18. Zgurskaya H.I. i wsp.: Mechanism and function of the outer membrane channel TolC in multidrug resistance and physiology of enterobacteria. „Front. Microbiol.”, 2011, 2, 189.
19. Andersen C. i wsp.: Transition to the open state of the TolC periplasmic tunnel entrance. „PNAS USA”, 2002, 99 (17), 11103–11108.
20. Koronakis V. i wsp.: Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export. „Nature”, 2000, 405 (6789), 914–919.
21. Horiyama T., Yamaguchi A., Nishino K.: TolC dependency of multidrug efflux systems in Salmonella enterica serovar Typhimurium. „J. Antimicrob. Chemother.”, 2010, 65, 1372–1376.
22. Nishino K., Latifi T., Groisman E.A.: Virulence and drug resistance roles of multidrug efflux systems of Salmonella enterica serovar Typhimurium. „Mol. Microbiol.”, 2006, 59, 126–141.
23. Weng Y. i wsp.: Vibrio choleraeTolC is required for expression of the ToxR regulon. „Infect Immun.”, 2021, Epub ahead of print. PMID: 34310890.
24. Liu S. i wsp.: Characterization of resistance mechanisms of Enterobacter cloacae complex co-resistant to carbapenem and colistin. „BMC Microbiol.”, 2021, 21 (1).
25. Raspoet R. i wsp.: The Salmonella Enteritidis TolC outer membrane channel is essential for egg white survival. „Poult. Sci.”, 2019, 98 (5), 2281–2289.
26. Hou B. i wsp.: TolC Promotes ExPEC Biofilm Formation and Curli Production in Response to Medium Osmolarity. „BioMed Res. Int.”, 2014, 2014, 574274.
27. Greene N.P. i wsp.: Antibiotic resistance mediated by the MacB ABC transporter family: A structural and functional perspective. „Front. Microbiol.”, 2018, 9, 950.
28. Fitzpatrick A.W.P. i wsp.: Structure of the MacAB-TolC ABC-type tripartite multidrug efflux pump. „Nat. Microbiol.”, 2017, 2, 17070.
29. Yamanaka H. i wsp.: MacAB is involved in the secretion of Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. „J. Bacteriol.”, 2008, 190 (23), 7693–7698.
30. Hinchliffe P. i wsp.: Structure of the periplasmic adaptor protein from a major facilitator superfamily (MFS) multidrug efflux pump. „FEBS Letters”, 2014, 588 (17), 3147–3153.
31. http://bacmet.biomedicine.gu.se/advanced_BacMet_EXP_connect_to_ALL.pl?gene=tolC.
32. Krzyżewska E. i wsp.: Modifications of cell structure of microorganisms induced by biocides. „Post. Mikrobiol.”, 2015, 54 (4), 380–391.
33. Atzori A. i wsp.: Identification and characterization of carbapenem binding sites within the RND-transporter AcrB. „BBA – Biomembranes.”, 2019, 1861 (1), 62–74.
34. Bhandol H. i wsp.: Review: Structure and transcriptional regulation of the Acr efflux pumps and their role in antibiotic resistance in Escherichia coli. „UJEMI”, 2020, 6, 1–16.
35. Kumar A. i Schweizer H.P.: Bacterial resistance to antibiotics: Active efflux and reduced uptake. „Adv. Drug Deliv. Rev.”, 2005, 57 (10), 1486–1513.
36. Rosenberg E.Y., Ma D. i Nikaido H.: AcrD of Escherichia coli is an aminoglycoside efflux pump. „J. Bacteriol.”, 2000, 182 (6), 1754–1756.
37. Zhang C.Z. i wsp.: Upregulation of AcrEF in Quinolone Resistance Development in Escherichia coli When AcrAB-TolC Function Is Impaired. „Microb. Drug Resistance”, 2018,  24 (1), 18–23.
38. Nagakubo S. i wsp.: The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC. „J. Bacteriol.”, 2002, 184 (15), 4161–4167.
39. Anes J. i wsp.: The ins and outs of RND efflux pumps in Escherichia coli. „Front. Microbiol.”, 2015, 6, 1–14.
40. Schmidt T.H. i wsp.: Computer simulations suggest direct and stable tip to tip interaction between the outer membrane channel TolC and the isolated docking domain of the multidrug RND efflux transporter AcrB. „Biochim. Biophys. Acta.”, 2016, 1858 (7), 1419–1426.
41. Kobayashi K., Tsukagoshi N., i Aono R.: Suppression of hypersensitivity of Escherichia coli acrB mutant to organic solvents by integrational activation of the acrEF operon with the IS1 or IS2 element. „J. Bacteriol.”, 2001, 183, 2646–2653.
42. Chetri S. i wsp.: Transcriptional response of AcrEF-TolC against fluoroquinolone and carbapenem in Escherichia coli of clinical origin. „Indian J. Med. Microbiol.”, 2018, 36 (4), 537–540.

mgr Angelika Proskurnicka ¹
dr Bożena Futoma-Kołoch ^2
1 Zakład Fizykochemii Drobnoustrojów, Wydział Nauk Biologicznych, Uniwersytet Wrocławski
² Zakład Mikrobiologii, Wydział Nauk Biologicznych, Uniwersytet Wrocławski