Nowoczesna metoda identyfikacji mikroorganizmów

Autorzy: dr n. med. Kamila Korzekwa , dr n. biol. Piotr Nowaczyk , mgr Michał Wronecki Data publikacji: 10.10.2024 r. Numer wydania: 1/2019

Mikrobiologia Farmacja i kosmetologia

Producenci i dystrybutorzy produktów kosmetycznych powinni starać się uczulać użytkowników na negatywne skutki złego przechowywania czy korzystania z kosmetyku, co w konsekwencji może prowadzić do niebezpiecznych infekcji bakteryjnych czy grzybiczych.

Title: A modern method of microorganisms identification

Streszczenie: Kosmetyki, jako przedmioty codziennego użytku, przeznaczone do kontaktu z ciałem człowieka, nie mogą stanowić dla niego niebezpieczeństwa. Eliminując możliwość przedostania się patogennych mikroorganizmów do produktu kosmetycznego, zmniejsza się prawdopodobieństwo ryzyka wystąpienia infekcji bakteryjnych czy grzybiczych spowodowanych tymi drobnoustrojami. Znając potencjalne źródła skażeń, można im zapobiegać zarówno na etapie produkcji, jak i w trakcie użytkowania produktu przez konsumenta.

Słowa kluczowe: kosmetyk, mikroorganizmy, produkt, źródło zanieczyszczenia, identyfikacja mikroorganizmów

Summary: Cosmetics, as products for daily use, designed for contact with the human body, cannot pose risk for it. By eliminating the possibility of the penetration of pathogenic microorganisms into the product, the probability of the bacterial or fungal infection occurrence is reduced. The knowledge of the sources of potential contamination can help prevent them at the production stage as well as while using the product by a consumer.

Keywords: cosmetic, microorganisms, product, contamination source, microorganisms identification

Zgodnie z definicją zawartą w Rozporządzeniu Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1223/2009 z 30 listopada 2009 r., „produkt kosmetyczny” oznacza każdą substancję lub mieszaninę przeznaczoną do kontaktu z zewnętrznymi częściami ciała ludzkiego (naskórkiem, owłosieniem, paznokciami, wargami oraz zewnętrznymi narządami płciowymi) lub z zębami oraz błonami śluzowymi jamy ustnej, którego wyłącznym lub głównym celem jest utrzymywanie ich w czystości, perfumowanie, zmiana ich wyglądu, ochrona, utrzymywanie w dobrej kondycji lub korygowanie zapachu ciała [1].

Kosmetyki z założenia nie są produktami jałowymi, produkowanymi według ściśle określonych norm, w ściśle określonych warunkach. Czasami dochodzi do ich skażeń, co może prowadzić do poważnych i niebezpiecznych dla zdrowia człowieka konsekwencji [2].

Zanieczyszczenia pierwotne kosmetyków

Wszystkie etapy produkcji kosmetyków, od nabycia surowców, a następnie podczas ich przetwarzania i dystrybucji, niosą ze sobą ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Wynika ono z obecności mikroorganizmów w surowcach, z których są wywarzane, czy w urządzeniach produkcyjnych. Do ich zanieczyszczenia może dojść w wyniku przedostania się patogenów, np. z powietrza lub wody. Wiele surowców, które są wykorzystywane w produkcji kosmetyków, może być źródłem mikroorganizmów. Może to powodować niebezpieczne i poważne konsekwencje dla zdrowia, dlatego potencjalne źródła zanieczyszczenia mikrobiologicznego kosmetyków powinny być w jak największym stopniu zminimalizowane.

Zanieczyszczenie mikrobiologiczne kosmetyków jest bardzo istotnym problemem w przemyśle kosmetycznym, stanowią główną przyczynę utraty dobrego wizerunku dla firmy, co wiąże się ze stratami ekonomicznymi. Problemy czystości mikrobiologicznej mogą doprowadzić do negatywnego wpływu na zdrowie konsumenta. Kosmetyki są podatne na zanieczyszczenia drobnoustrojami z uwagi na obecność w nich wody oraz składników odżywczych, które są idealnym medium do rozwoju mikroorganizmów. Często zdarza się, że drobnoustroje są przyczyną zmian organoleptycznych kosmetyku, tj. zmiany lepkości, barwy czy zapachu. Zdarzały się też przypadki zagrażające zdrowiu użytkowników, na skutek korzystania z produktów zanieczyszczonych mikrobiologicznie [3].

Każdy wytwórca produktu kosmetycznego na terenie Unii Europejskiej jest zobowiązany przekazać wszystkie informacje dotyczące kosmetyku do europejskiego systemu CPNP (Cosmetic Products Notification Portal). Ponadto, zgodnie z obowiązującą od 1 stycznia 2019 r. nową Ustawą o produktach kosmetycznych, został powołany System Informowania o Ciężkich Działaniach Niepożądanych spowodowanych stosowaniem produktów kosmetycznych [4].

Począwszy od etapu produkcji, kosmetyk narażony jest na zanieczyszczenia różnymi patogennymi mikroorganizmami. Dlatego bardzo ważna jest higiena produkcji. Przepisy prawne nie regulują jednoznacznie, w jaki sposób producent ma zabezpieczyć surowce i linię produkcyjną przed zanieczyszczeniem. Zalecane jest przestrzeganie zasad GMP, czyli dobrej praktyki produkcyjnej. Regulacje te pozwalają na ograniczenie kontaktu surowców i produktu z potencjalnie niebezpiecznymi drobnoustrojami. Nie tylko produkt „w masie” narażony jest na zanieczyszczenie. Dotyczy to również produktów gotowych, w takiej formie, w jakiej trafiają do konsumenta. Dlatego też prowadzone są badania czystości mikrobiologicznej produktu zarówno przed konfekcjonowaniem, jak i po nim. Dzięki temu do sprzedaży przekazywane są kosmetyki pozbawione zanieczyszczeń [5, 6].

Czystość mikrobiologiczna również jest pojęciem sprecyzowanym prawnie. W przepisach prawnych znaleźć można informacje o tym, jaki jest dopuszczalny poziom skażenia produktu drobnoustrojami, a jakich w ogóle nie może w nim być. Przepisy jednoznacznie wskazują na prowadzenie badań w kierunku obecności czterech gatunków drobnoustrojów: bakterii S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oraz Candida albicans. Patogeny te odpowiedzialne są za groźne infekcje, będące bardzo uciążliwymi schorzeniami, takimi jak grzybice, zapalenie rogówki, zmiany skórne [5, 7].

Zanieczyszczenia wtórne kosmetyków

Do zanieczyszczenia kosmetyków może dojść nie tylko w trakcie produkcji, ale także w domu konsumenta. Na zanieczyszczenie produktów w trakcie użytkowania ma wpływ wiele czynników. Do najważniejszych należy niewłaściwe przechowywanie oraz sposób użytkowania [8]. Także ogromny wpływ na prawdopodobieństwo proliferacji komórek drobnoustrojów wewnątrz opakowania z kosmetykiem ma jego wielkość, rodzaj zamknięcia, a także liczba osób z niego korzystająca [8, 9]. Negatywny wpływ na zawartość opakowania ma także rozcieńczanie kosmetyków wodą. Ponieważ w wodzie wodociągowej znajdują się bakterie, oczywista jest możliwość ich rozwoju wewnątrz opakowania kosmetyku. Zanieczyszczenia w trakcie użytkowania wynikające z nieprzestrzegania zasad higieny prowadzą do zanieczyszczenia kosmetyków florą fizjologiczną człowieka [8]. Korzystanie z opakowań, których średnica otworu jest duża, również zwiększa prawdopodobieństwo rozwoju bakterii obecnych na skórze użytkownika [9]. W przypadku przedostania się bakterii z powierzchni skóry do kosmetyku może dojść do ich proliferacji, a w konsekwencji przy następnym jego zastosowaniu rośnie ryzyko rozwinięcia się infekcji.

Wszelkiemu niebezpieczeństwu związanemu z nieodpowiednim użytkowaniem kosmetyku mają zapobiec konserwanty. Ograniczają one wzrost bakterii oraz grzybów, uniemożliwiając ich rozwój, który mógłby zagrozić zdrowiu konsumenta. Aby dobrać odpowiedni konserwant lub ich układ, stosuje się test konserwacji. Pozwala on na oznaczenie, jakie stężenie jest wystarczające, aby chronić kosmetyk, a tym samym konsumenta [10-12].

W przypadku, kiedy wszystkie działania mające chronić konsumenta nie będą wystarczające, może dojść do rozwoju wielu chorobotwórczych mikroorganizmów. Wśród najczęściej pojawiających się infekcji wyróżniają się te spowodowane przez P. aeruginosa. Bakterie te często odpowiedzialne są za zakażenia oka, a kosmetykiem, w którym dochodzi do ich proliferacji, jest tusz do rzęs [13, 14]. Jednak nie tylko drobnoustroje wywołują zmiany chorobowe. Często zdarza się, że w składzie kosmetyku znajduje się substancja mogąca wywołać alergię. Substancją tą mogą być zarówno komponenty naturalne, np. zioła, jak i konserwanty. Wywołują one najczęściej skórną reakcję alergiczną [15].

Kryteria czystości mikrobiologicznej kosmetyków

Głównym celem wszystkich producentów winno być to, aby konsument miał gwarancję bezpieczeństwa podczas korzystania z danego produktu w warunkach domowych. W związku z tym, że zanieczyszczenie mikrobiologiczne danego produktu może być szkodliwe dla użytkownika i spowodować pogorszenie jakości kosmetyku, należy je ograniczać poprzez:

zachowanie higieny w zakładzie produkcyjnym,
odpowiednie zakonserwowanie produktu,
przestrzeganie granic czystości mikrobiologicznej.

Aby zapewnić prawidłową jakość mikrobiologiczną kosmetyków, wskazane jest prowadzenie rutynowych badań mikrobiologicznych dla każdej partii wyrobu gotowego, która jest wprowadzana do obrotu. Ponieważ wielkość danej partii może być różna, laboratorium samo określa liczbę próbek z danej partii przeznaczonych do analiz mikrobiologicznych, definiując ryzyko mikrobiologiczne [16].

Norma PN-EN ISO 17516:2014-11 [17] określa dopuszczalne limity mikrobiologiczne dla kosmetyków. Jeśli chodzi o wymagania ilościowe w próbce o wielkości 1 g lub 1 ml:

dla kosmetyków przeznaczonych do specjalnego stosowania, dla dzieci poniżej 3. r.ż. oraz w okolicach oczu i błon śluzowych (kategoria I): ogólna liczna drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 100 cfu/g lub ml,
dla kosmetyków pozostałych (kategoria II): ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 1000 cfu/g lub ml [50].

Natomiast w przypadku wymagań jakościowych jasno określone jest, że w 1 g lub 1 ml próbki kosmetyku nie mogą być obecne drobnoustroje specyficzne, takie jak: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

Są to drobnoustroje, na obecność których każda partia kosmetyków, jak i surowców jest badana obowiązkowo. Dodatkowo przeprowadza się badania na obecność drobnoustrojów niespecyficznych, do których należą: Pseudomonas putida, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter gergoviae, Enterobacter cloacae, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Micrococcus spp., Citrobacter freundii, Moraxella spp., Neisseria spp., Acinetobacter spp. [18].

Procedury identyfikacji mikroorganizmów, zgodnie z normami ISO dla produktów kosmetycznych, obejmują trzy etapy badawcze [18]:

Przygotowanie zawiesiny i namnażanie wstępne na bulionie nieselektywnym.
Namnażanie i izolację na selektywnej pożywce agarowej.
Badania identyfikacyjne.

Nowoczesna metoda identyfikacji drobnoustrojów

Bardzo ważne z punktu widzenia przemysłu kosmetycznego jest to, aby wynik testów identyfikacji drobnoustrojów uzyskać możliwie jak najszybciej. Przy obecnie stosowanych technikach mikrobiologicznych oznaczanie drobnoustroju trwa od 2 do 7 dni, a w procedurze stosuje się kilka różnych pożywek (na jedną analizę).

Dostępne na rynku mikrobiologicznym testy diagnostyczne stają się coraz prostsze w wykonaniu, a czas wykonania badań jest coraz krótszy. Jednocześnie, im mniej czynności wykonanych manualnie przez analityka, tym mniejsza możliwość zanieczyszczenia próbki i wydania fałszywie dodatnich wyników badań, stąd dążenie do maksymalnego upraszczania wykonywania badań. Urządzenie Avlee 650 (Bioavlee S.A., Polska) wpasowuje się w te trendy, ponieważ pozwala na każdorazowe przeprowadzenie dokładnej analizy w krótszym czasie oraz przy nakładzie mniejszych kosztów. Ponadto zapewnia możliwość oszacowania liczby kolonii na tej samej szalce, która służy do identyfikacji.

Nową metodą służącą do bardzo szybkiej i poprawnej identyfikacji drobnoustrojów jest technika identyfikacji bakterii w oparciu o zjawisko dyfrakcji światła laserowego.

Bioavlee S.A. oferuje system do identyfikacji mikroorganizmów oparty na nowatorskiej, opatentowanej metodzie zjawiska dyfrakcji laserowej. Urządzenia oraz system do wykrywania i identyfikacji kolonii mikroorganizmów – w pierwszej wersji jest kierowane do laboratoriów kosmetycznych, w przyszłości znajdzie zastosowanie także w laboratoriach związanych z przemysłem spożywczym. Przedstawiony produkt to nie tylko urządzenie realizujące detekcję. To cały system składający się z algorytmów klasyfikacji, referencyjnej bazy zdjęć, systemu sterowania przetwarzania obrazu czy atlasów w chmurze i rozbudowanej infrastruktury IT do analityki. Działa w oparciu o opatentowaną metodę analizy widm dyfrakcyjnych. Technologia identyfikacji wykorzystuje fakt, że kolonie mikroorganizmów wykazują specyficzne właściwości optyczne (współczynnik absorpcji oraz załamania światła) oraz morfologiczne (profil, kształt krawędzi). Jest to jedna z najnowszych technik identyfikacji bakterii z wykorzystaniem światła. W odróżnieniu od innych technik optycznych opierających się na oddziaływaniu światła z pojedynczymi komórkami bakterii lub ich zawiesinami, omawiana technika wykorzystuje oddziaływanie światła z makroskopowymi strukturami bakterii – koloniami bakterii [19-21]. Jest to możliwe dzięki związkowi cech genotypowych komórek bakterii z cechami fenotypowymi formowanych przez nie makrostruktur. Kolonie różnych gatunków bakterii wykazują różne cechy morfologiczne (kształt krawędzi, profil, chropowatość powierzchni etc.) oraz optyczne (współczynnik załamania światła, współczynnik absorpcji/transmisji światła), które wpływają na specyficzną modulację wiązki światła laserowego przez kolonie [22]. W wyniku transformacji światła na koloniach bakterii, związanej głównie ze zjawiskiem dyfrakcji/ugięcia światła, każda z nich generuje unikalne dla każdego gatunku i wzorce dyfrakcyjne w postaci dwuwymiarowych rozkładów przestrzennych natężenia światła ugiętego, które można traktować jak optyczne, a ściślej mówiąc – dyfrakcyjne, odciski palców bakterii. Przykładowe wzorce dyfrakcyjne przedstawiono na fot. 1-6.

Zaawansowane metody statystyczne i algorytmy komputerowe pozwalają na wyodrębnienie cech osobniczych tych wzorców optycznych oraz budowę w oparciu o nie modeli klasyfikacyjnych pozwalających na skuteczną i szybką identyfikację bakterii [23]. Z doniesień literaturowych wynika, że technika ta pozwala na klasyfikację gatunku bakterii z blisko 98-proc. skutecznością [24].

Jednakże, z uwagi na fakt, że rozwój kolonii bakterii jest silnie uzależniony od warunków ich inkubacji (rodzaj pożywki, temperatury i czasu inkubacji etc.), w przypadku tej techniki wymagana jest ich pełna standaryzacja [25]. Należy zaznaczyć, że w przypadku omawianej techniki wykorzystywane są próbki w postaci kolonii bakterii na stałych pożywkach hodowlanych. Ten sposób przygotowania próbek należy do „złotego standardu” diagnostyki mikrobiologicznej i jest powszechnie wykorzystywany w większości laboratoriów diagnostycznych. Tym samym możliwa jest identyfikacja próbek już na wstępnym etapie przygotowania próbek mikrobiologicznych dla innych technik identyfikacji. Ponadto, w odróżnieniu od technik biochemicznych, immunologicznych czy też immunoenzymatycznych nie wymaga ona każdorazowego wykorzystania dodatkowych odczynników chemicznych lub znaczników immunologicznych. Dodatkowo, w przeciwieństwie do innych metod, wykorzystanie światła jako nośnika informacji o gatunku i szczepie bakterii gwarantuje nieniszczący i bezkontaktowy charakter pomiaru. Oznacza to, że ta sama próbka może zostać wykorzystana w dalszej pracy laboratoryjnej. Identyfikacja bakterii w oparciu o wzorce optyczne obiektów makroskopowych (kolonii bakterii), a nie pojedynczych komórek bakteryjnych lub ich zawiesin, pozwala na znacznie ograniczenie wymogów odnośnie rozdzielczości i czułości pomiarowej wykorzystywanych systemów detekcji.

Podsumowanie

Zarówno producent, jak i konsument powinni dołożyć wszelkich starań, żeby zapobiec wszelkim skutkom ubocznym spowodowanym przed produkt kosmetyczny. Jak już wcześniej zostało wspomniane, nie tylko od producenta zależy nieszkodliwość produktu kosmetycznego – w równym stopniu uzależnione jest to od świadomości konsumenta. Producenci i dystrybutorzy produktów kosmetycznych powinni większą wagę przywiązywać do tego zjawiska. Powinni starać się uczulać użytkowników na negatywne skutki złego przechowywania czy korzystania z kosmetyku, co w konsekwencji może prowadzić do niebezpiecznych infekcji bakteryjnych czy grzybiczych. Odpowiedzialność za potencjalne zagrożenie spoczywa zarówno na producencie, jako podmiocie odpowiedzialnym, jak i na użytkownikach produktów kosmetycznych [3, 4, 16]. Producenci dostarczają na rynek produkty bezpieczne i to od konsumenta zależy, czy dalej takie pozostaną.

Piśmiennictwo

Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1223/2009 z dnia 30 listopada 2009 r. dotyczące produktów kosmetycznych.
Obrębska K., Szczygła A., Matejczyk M.: Skażenia mikrobiologiczne surowców i produktów kosmetycznych. „Postępy Mikrobiologii”, 2008, 47, 1, 65-71.
Bojarowicz H., Wojciechowska M., Gocki J.: Substancje konserwujące stosowane w kosmetykach oraz ich działania niepożądane. „Probl. Hig. Epidemiol.”, 2008, 89 (1), 30-33.
Ustawa z dnia 4 października 2018 r. o produktach kosmetycznych (Dz.U. z 2018 r., poz. 2227).
Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z.: Mikrobiologia techniczna. Mikroorganizmy w biotechnologii, ochronie środowiska i produkcji żywności. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009.
Campana R., Scesa C., Patrone V., Vittoria E., Baffone W.: Microbiological study of cosmetic products during their use by consumers: health risk and efficacy of preservative system. „Letters in Applied Microbiology”, 2006, 43, 301-306.
Obrębska K.B., Szczygła A., Matejczyk M.: Skażenia mikrobiologiczne surowców i produktów kosmetycznych. „Postępy Mikrobiologii”, 2008, 47, 1, 65-71.
Jaworska E.: Testy konserwacji – niezbędne badania w specyfikacji mikrobiologicznej gotowego produktu kosmetycznego. „Świat Przemysłu Kosmetycznego”, 2011, 3 (8), 22-24.
Garbolińska M.: Kontrola mikrobiologiczna w przemyśle kosmetycznym. „Świat Przemysłu Kosmetycznego”, 2010, 2, 26-29.
Kurpiell M.: Testy konserwacji. Materiały pobrano w styczniu 2010 r. i są dostępne pod adresem: www.biotechnologia.pl/kosmetologia/37/1060.
Wojciechowska M., Gocki J., Bartuzi Z.: Alergia na kosmetyki. „Pol. Merk. Lek.”, 2008, 145, XXV, 87.
Bojarowicz H., Wojciechowska M., Gocki J.: Substancje konserwujące stosowane w kosmetykach oraz ich działania niepożądane. „Probl. Hig. Epidemiol.”, 2008, 89 (1), 30-33.
Brud W.S., Glinka R.: Technologia kosmetyków. Oficyna Wydawnicza MA, Łódź 2001.
Bugaj A.M.: Jakość i bezpieczeństwo kosmetyków. Wydawnictwo ANKROM S.C. AMF, Warszawa 2013, 90-98.
Greber K.: Środki konserwujące w kosmetykach – konieczność czy zbędny balast. „Laborant”, 2013, 6, 6-12.
Załącznik do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 23 grudnia 2002 r. Kryteria czystości chemicznej i mikrobiologicznej kosmetyków oraz metody kontroli zgodności z tymi kryteriami.
PN-EN ISO 17516:2014-11 Kosmetyki-Mikrobiologia-Limity mikrobiologiczne.
Nowaczyk P., Korzekwa K.: Atlas mikrobiologii kosmetyków, Wydawnictwo Poligraf, Brzezia Łąka, 2018.
Buzalewicz I., Podbielska H.: Current trends of innovations in microbiological diagnosis by light diffraction. [In:] Innovations in biomedical engineering. Eds. M. Gzik, E. Tkacz, Z. Paszenda, E. Piętka, „Advances in Intelligent Systems and Computing”, vol. 526, Springer, 2017, 267-275.
Buzalewicz I., Kowal K., Linard M., Suchwałko A.P., Podbielska H.: Advances in label-free sensing of bacteria by light diffraction phenomenon. [In:] Advances in optics: reviews. Book series, vol. 3, ed. Sergey Y. Yurish, 2018 169-196.
Buzalewicz I.: Pomiary optyczne w mikrobiologii. [W:] Metrologia dziś i jutro. Red. J. Jakubiec, Z. Moroń, H. Juniewicz, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, 2010, 357-368.
Suchwałko A., Buzalewicz I., Wieliczko A., Podbielska H.: Bacteria species identification by the statistical analysis of bacterial colonies Fresnel patterns. „Optics Express”, 2013, 21 (9), 11322-11337.
Suchwałko A., Buzalewicz I., Podbielska H.: Statistical identification of bacteria species, Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education. Vol. 1, ed. A. Mendez-Vilas, Formatex Research Center, 2013, 711-721.
Suchwałko A., Buzalewicz I., Podbielska H.: Bacteria identification in an optical system with optimized diffraction pattern registration condition supported by enhanced statistical analysis. „Optics Express”, 2014, 22 (21), 26312-26327.
Buzalewicz I., Wieliczko A., Podbielska H.: Influence of various growth conditions on Fresnel diffraction patterns of bacteria colonies examined in the optical system with converging spherical wave illumination. „Optics Express”, 2011, 19 (22), 21768-21785.