Derywatyzacja w chromatografii gazowej. Przegląd metod i reagentów

Acylowanie

Odczynniki acylujące mają szczególne znaczenie w analizie związków, zawierających w swej strukturze grupy hydroksylowe lub aminowe, szczególnie jeśli nie ulegają one łatwo reakcjom sililowania. Spośród dostępnych odczynników, najczęściej stosowane są bezwodniki kwasów organicznych, począwszy od bezwodnika octowego, używane są także bezwodniki stosunkowo mocnych kwasów zawierających atomy fluoru w strukturze [16-18]. Dodatkowo można je zastosować w przypadku planowanej detekcji ECD, co zwiększy możliwość analizy związków obecnych w niskich stężeniach. Pewne zastosowanie mają także perfluorowane chlorki acylowe oraz nieliczne inne odczynniki, np. N-metylo-bis(trifluoroacetamid) (MBTFA). O ile znaczna część odczynników jest stosunkowo agresywna chemicznie, o tyle warunki prowadzenia reakcji są łagodne – w wielu przypadkach wystarczająca jest temperatura pokojowa. Struktury powszechnie stosowanych reagentów są przedstawione na rys. 3.

Pochodne acylowe różnego rodzaju są chętnie stosowane jako alternatywa pochodnych sililowych w analizie steroli, triterpenoli, a także alkoholi drugo- i trzeciorzędowych. W przypadku amin, są podstawową grupą pochodnych o szczególnie dużym znaczeniu, gdyż wiele z tych związków trudno ulega reakcji sililowania bądź nie ulega jej wcale. Szczególne przypadki reakcji acylowania zostaną omówione w kolejnym artykule.

Reakcje dwuetapowe i przypadki specjalne

Dwuetapowa synteza pochodnych, choć wydłuża procedurę analityczną i wymaga większej liczby odczynników, może w niektórych przypadkach być najlepszą dostępną możliwością derywatyzacji, prowadzącą do produktów, które skutecznie rozdzielają się przy użyciu GC oraz są łatwe w identyfikacji przy zastosowaniu techniki GC-MS. Przykładem takiej procedury może być synteza pochodnych mono- i disacharydów, w której najpierw tworzy się oksymy przy użyciu chlorowodorku hydroksyloaminy, a następnie przekształca wolne grupy hydroksylowe w pochodne TMSi przy użyciu BSTFA [19, 20]. Przy zastosowaniu wyłącznie pochodnych drugiego typu, obecność niektórych sacharydów (np. glukoza i fruktoza) manifestuje się na chromatogramie gazowym w formie czterech-pięciu słabo rozdzielonych sygnałów. Procedura dwuetapowa pozwala ograniczyć liczbę sygnałów im odpowiadających do dwóch, co umożliwia analizę ilościową i jakościową. Podobnie w przypadku aminokwasów korzystne jest przeprowadzenie grupy karboksylowej w postać pochodnej TMSi oraz poddanie grupy aminowej acylowaniu [21], dzięki czemu uzyskiwane są pochodne łatwe do identyfikacji i analizy ilościowej nawet w próbkach biologicznych. Kwasy karboksylowe, zawierające w swej strukturze grupy hydroksylowe oraz czasami epoksydowe, powstałe na drodze hydrolizy polimeru roślinnego suberyny, identyfikowano z kolei w formie podwójnych pochodnych, w których grupę karboksylową poddano metylowaniu przy użyciu TMSD, a następnie przekształcono grupy hydroksylowe do odpowiednich pochodnych TMSi [22]. Alternatywne podejście, zakładające przekształcenie wszystkich grup funkcyjnych w pochodne TMSi, skutkowało trudnościami w identyfikacji bardziej skomplikowanych strukturalnie składników próbki, ze względu na niezbyt charakterystyczne widma mas.

W przypadku związków dwufunkcyjnych ciekawą alternatywą dla procedury dwuetapowej może być znalezienie odczynnika, który będzie umożliwiał przeprowadzenie obu grup w odpowiednie pochodne. Spośród odczynników opisanych wcześniej taką możliwość daje większość reagentów stosowanych w reakcji sililowania, ale identyfikacja uzyskanych pochodnych jest często trudna. Dla kwasów tłuszczowych zawierających grupę hydroksylową takim reagentem okazał się być jodek metylu w polarnym, aprotycznym rozpuszczalniku (dimetyloacetamidzie), który przekształca grupy karboksylowe w estry metylowe, a grupy hydroksylowe – w odpowiednie etery metylowe [23]. Dla stosunkowo lotnych, małocząsteczkowych kwasów dwukarboksylowych ciekawą alternatywą dla pochodnych di-TMSi okazały się być estry butylowe [24]. Estry pikolinowe są stosowane w przypadku kwasów tłuszczowych o bardziej skomplikowanej strukturze, umożliwiając np. lokalizację rozgałęzień łańcucha oraz wiązań podwójnych [25]. W przypadku stosowania jednoetapowej procedury derywatyzacji aminokwasów wyniki uzyskiwane przez różnych autorów sugerują różną przydatność poszczególnych procedur [26, 27], stąd proponowana wcześniej synteza dwuetapowa jako atrakcyjna alternatywa.

Poza oceną przydatności poszczególnych odczynników, stosowanych do derywatyzacji, postęp w zakresie syntezy pochodnych odbywa się także w rozwiązaniach technicznych oraz w samodzielnym opracowywaniu nowych odczynników, o prawdopodobnej wysokiej przydatności. Skrócenie procedury analitycznej, szczególnie w przypadku analizowania dużej liczby próbek, jest szczególnie pożądanym efektem optymalizacji pracy. W zakresie syntezy pochodnych oraz zastosowania techniki GC, na uwagę zasługuje derywatyzacja związków wyekstrahowanych za pomocą mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), bezpośrednio na powierzchni włókna ekstrakcyjnego. Pochodne są następnie wprowadzane na włóknie do dozownika chromatografu gazowego. Takie procedury opisano m.in. dla prostych związków aromatycznych analizowanych w moczu [28] oraz fitoestrogenów obecnych w mleku zwierzęcym [29]. Przykładem opracowania nowego reagenta jest synteza związku służącego do sililowania, nazwanego DIMETRIS (dimetylo-(3,3,3-trifluoropropylo)sililodietyloamina), który pozwala na wprowadzenie do struktury substancji oznaczanych atomów fluoru, umożliwiając tym samym detekcję ECD. Reagent został następnie skutecznie zastosowany do oznaczania β-blokerów [30], naturalnych i syntetycznych estrogenów [31] oraz niesteroidowych leków przeciwzapalnych [32].

Powyższy, siłą rzeczy bardzo krótki przegląd możliwości stosowania różnych pochodnych w analizie GC, przedstawia tylko wybrane aspekty tego szerokiego tematu. W kolejnym artykule omówiona zostanie ocena skuteczności procedur derywatyzacji oraz porównanie różnych metod syntezy pochodnych.

Piśmiennictwo

1. Ahuja S.: Derivatization in gas chromatography. „Journal of Pharmaceutical Sciences”, 1976, 65, 163-182.
2. Orata F.: Derivatization reactions and reagents for gas chromatography analysis. „Advanced Gas Chromatography − Progress in Agricultural, Biomedical and Industrial Applications”, IntechOpen, 2012.
3. Halket J.M., Waterman D., Przyborowska A.M., Patel R.K.P., Fraser P.D., Bramley P.M.: Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS. „Journal of Experimental Botany”, 2005, 56, 219-243.
4. Wells R.J.: Recent advances in non-silylation derivatization techniques for gas chromatography. „Journal of Chromatography A”, 1999, 843, 1-18.
5. Halket J.M., Zaikin V.G.: Derivatization in mass spectrometry − 5. Specific derivatization of monofunctional compounds. „European Journal of Mass Spectrometry”, 2005, 11, 127-160.
6. Halket J.M., Zaikin V.G.: Derivatization in mass spectrometry − 1. Silylation. „European Journal of Mass Spectrometry”, 2003, 9, 1-21.
7. Schummer C., Delhomme O., Appenzeller B.M.R., Wenning R., Millet M.: Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis. „Talanta”, 2009, 77, 1473-1482.
8. Little J.L.: Artifacts in trimethylsilyl derivatization reactions and ways to avoid them. „Journal of Chromatography A”, 1999, 844, 1-22.
9. Quéro A., Jousse C., Lequart-Pillon M., Gontier E., Guillot X., Courtois B., Courtois J., Pau-Roblot C.: Improved stability of TMS derivatives for the robust quantification of plant polar metabolites by gas chromatography − mass spectrometry. „Journal of Chromatography B”, 2014, 970, 36-43.
10. Liu K.S.: Preparation of fatty acid methyl esters for gas-chromatographic analysis of lipids in biological materials. „Journal of the American Oil Chemists’ Society”, 1994, 71, 1179-1187.
11. Halket J.M., Zaikin V.G.: Derivatization in mass spectrometry − 3. Alkylation (arylation). „European Journal of Mass Spectrometry”, 2004, 10, 1-19.
12. Aldai N., Murray B.E., Najera A.I., Troy D.J., Osoro K.: Derivatization of fatty acids and its application for conjugated linoleic acid studies in ruminant meat lipids. „Journal of the Science of Food and Agriculture”, 2005, 85, 1073-1083.
13. Park Y., Albright K.J., Cai Z.Y., Pariza M.W.: Comparison of methylation procedures for conjugated linoleic acid and artifact formation by commercial (trimethylsilyl)diazomethane. „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2001, 49, 1158-1164.
14. Migowska N., Stepnowski P., Paszkiewicz M., Gołębiowski M., Kumirska J.: Trimethylsilyldiazomethane (TMSD) as a new derivatization reagent for trace analysis of selected non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by gas chromatography methods. „Analytical and Bioanalytical Chemistry”, 2010, 397, 3029-3034.
15. van’t Erve T.J., Rautiainen R.H., Robertson L.W., Luthe G.: Trimethylsilyldiazomethane: A safe non-explosive, cost effective and less-toxic reagent for phenol derivatization in GC applications. „Environment International”, 2010, 36, 835-842.
16. Zaikin V.G, Halket J.M.: Derivatization in mass spectrometry − 2. Acylation. „European Journal of Mass Spectrometry”, 2003, 9, 421-434.
17. Kataoka H.: Derivatization reactions for the determination of amines by gas chromatography and their applications in environmental analysis. „Journal of Chromatography A”, 1996, 733, 19-34.
18. Mohamed K.M., Bakdash A.: Comparison of 3 Derivatization methods for the analysis of amphetamine-related drugs in oral fluid by gas chromatography-mass spectrometry. „Analytical Chemistry Insights”, 2017, 12, 1-16.
19. Rojas-Escudero E., Alarcón-Jiménez A.L., Elizalde-Galvan P., Rojo-Callejas F.: Optimization of carbohydrate silylation for gas chromatography. „Journal of Chromatography A”, 2004, 1027, 117-120.
20. Ruiz-Matute A.I., Rodríguez-Sánchez S., Sanz M.L., Martínez-Castro I.: Detection of adulterations of honey with high fructose syrups from inulin by GC analysis. „Journal of Food Composition and Analysis”, 2010, 23, 273-276.
21. Yoon H.R.: Two step derivatization for the analyses of organic, amino acids and glycines on filter paper plasma by GC-MS/SIM. „Archives of Pharmaceutical Research”, 2007, 30, 387-395.
22. Correia V.G., Bento A., Pais J., Rodrigues R., Haliński Ł.P., Frydrych M., Greenhalgh A., Stepnowski P., Vollrath F., King A.W.T., Silva Pereira C.: The molecular structure and multifunctionality of the cryptic plant polymer suberin. „Materials Today Bio”, 2020, 5, 100039.
23. Johnson S.B., Brown R.E.: Simplified derivatization for determining sphingolipid fatty acyl composition by gas chromatography-mass spectrometry. „Journal of Chromatography”, 1992, 605, 281-286.
24. Pietrogrande M.C., Bacco D., Mercuriali M.: GC-MS analysis of low-molecular-weight dicarboxylic acids in atmospheric aerosol: comparison between silylation and esterification derivatization procedures. „Analytical and Bioanalytical Chemistry”, 2010, 396, 877-885.
25. Harvey D.J.: Picolinyl esters as derivatives for the structural determination of long chain branched and unsaturated fatty acids. „Biomedical Mass Spectrometry”, 1982, 9, 33-38.
26. Sobolevsky T.G., Revelsky A.I., Miller B., Oriedo V., Chemetsova E.S., Revelsky I.A.: Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. „Journal of Separation Science”, 2003, 26, 1474-1478.
27. Villas-Bôas S.G., Smart K.F., Sivakumaran S., Lane G.A.: Alkylation or silylation for analysis of amino and non-amino organic acids by GC-MS?. „Metabolites”, 2011, 1, 3-20.
28. Lourenço E.L.B., Ferreira A., Pinto E., Yonamine M., Farsky S.H.P.: On-fiber derivatization of SPME extracts of phenol, hydroquinone and catechol with GC-MS detection. „Chromatographia”, 2006, 63, 175-179.
29. Aresta A., Cotugno P., Zambonin C.: Solid-phase microextraction and on-fiber derivatization for assessment of mammalian and vegetable milks with emphasis on the content of major phytoestrogens. „Scientific Reports”, 2019, 9, 6398.
30. Caban M., Mioduszewska K., Stepnowski P., Kwiatkowski M., Kumirska J.: Dimethyl(3,3,3-trifluoropropyl)silyldiethylamine − A new silylating agent for the derivatization of β-blockers and β-agonists in environmental samples. „Analytica Chimica Acta”, 2013, 782, 75-88.
31. Caban M., Czerwicka M., Łukaszewicz P., Migowska N., Stepnowski P., Kwiatkowski M., Kumirska J.: A new silylation reagent dimethyl(3,3,3-trifluoropropyl)silyldiethylamine for the analysis of estrogenic compounds by gas chromatography-mass spectrometry. „Journal of Chromatography A”, 2013, 1301, 215-224.
32. Caban M., Mioduszewska K., Łukaszewicz P., Migowska N., Stepnowski P., Kwiatkowski M., Kumirska J.: A new silylating reagent − dimethyl(3,3,3-trifluoropropyl)silyldiethylamine – for the derivatisation of non-steroidal anti-inflammatory drugs prior to gas chromatography–mass spectrometry analysis. „Journal of Chromatography A”, 2014, 1346, 107-116.
33. Topolewska A., Czarnowska K., Haliński Ł.P., Stepnowski P.: Evaluation of four derivatization methods for the analysis of fatty acids from green leafy vegetables by gas chromatography. „Journal of Chromatography B”, 2015, 990, 150-157.
34. Migowska N., Caban M., Stepnowski P., Kumirska J.: Simultaneous analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs and estrogenic hormones in water and wastewater samples using gas chromatography–mass spectrometry and gas chromatography with electron capture detection. „Science of the Total Environment”, 2012, 441, 77-88.
35. Kotłowska A., Maliński E., Sworczak K., Kumirska J., Stepnowski P.: The urinary steroid profile in patients diagnosed with adrenal incidentaloma. „Clinical Biochemistry”, 2009, 42, 448-454.
36. Śramska P., Maciejka A., Topolewska A., Stepnowski P., Haliński Ł.P.: Isolation of atropine and scopolamine from plant material using liquid-liquid extraction and Extrelut® columns. „Journal of Chromatography B”, 2017, 1043, 202-208.
37. Laurila J., Laakso I., Väänänen T., Kuronen P., Huopalahti R., Pehu E.: Determination of solanidine- and tomatidine-type glycoalkaloid aglycons by gas chromatography/mass spectrometry. „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 1999, 47, 2738-2742.
38. Poole C.F.: Alkylsilyl derivatives for gas chromatography. „Journal of Chromatography A”, 2013, 1296, 2-14.
39. Ngim K.K., Ebeler S.E., Lew M.E., Crosby D.G., Wong J.W.: Optimized procedures for analyzing primary alkylamines in wines by pentafluorobenzaldehyde derivatization and GC-MS. „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2000, 48, 3311-3316.
40. Kumirska J., Migowska N., Caban M., Plenis A., Stepnowski P.: Chemometric analysis for optimizing derivatization in gas chromatography-based procedures. „Journal of Chemometrics”, 2011, 25, 636-643.
41. Li K., Liu S., Tan Y., Chao N., Tian X., Qi L., Powell W.A., Jiang X., Gai Y.: Optimized GC-MS method to simultaneously quantify acetylated aldose, ketose, and alditol for plant tissues based on derivatization in a methyl sulfoxide/1-methylimidazole system. „Journal of Agricultural and Food Chemistry”, 2013, 61, 4011-4018.
42. Bowden J.A., Colosi D.M., Mora-Montero D.C., Garrett T.J., Yost R.A.: Enhancement of chemical derivatization of steroids by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). „Journal of Chromatography B”, 2009, 877, 3237-3242.
43. Magi E., Liscio C., Di Carro M.: Multivariate optimization approach for the analysis of butyltin compounds in mussel tissues by gas chromatography–mass spectrometry. „Journal of Chromatography A”, 2008, 1210, 99-107.
44. Ranz A., Korpecka J., Lankmayr E.: Optimized derivatization of acidic herbicides with trimethylsilyldiazomethane for GC analysis. „Journal of Separation Science”, 2008, 31, 746-752.
45. Jemmali Z., Chartier A., Dufresne C., Elfakir C.: Optimization of the derivatization protocol of pentacyclic triterpenes prior to their gas chromatography–mass spectrometry analysis in plant extracts. „Talanta”, 2016, 147, 35-43.
46. Bekele E.A., Annaratone C.E.P., Hertog M.L.A.T.M., Nicolai B.M., Geeraerd A.H.: Multi-response optimization of the extraction and derivatization protocol of selected polar metabolites from apple fruit tissue for GC–MS analysis. „Analytica Chimica Acta”, 2014, 824, 42-56.
47. Liu K.S: Preparation of fatty acid methyl esters for gas-chromatographic analysis of lipids in biological materials. „Journal of the American Oil Chemists’ Society”, 1994, 71, 1179-1187.
48. Kohn G., van der Ploeg P., Möbius M., Sawatzki G.: Influence of the derivatization procedure on the results of the gaschromatographic fatty acid analysis of human milk and infant formulae. „Zeitschrift für Ernährungswissenschaft”, 1996, 35, 226-234.
49. Ostermann A.I., Müller M., Willebberg I., Schebb N.H.: Determining the fatty acid composition in plasma and tissues as fatty acid methyl esters using gas chromatography – a comparison of different derivatization and extraction procedures. „Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids”, 2014, 91, 235-241.
50. Wu C.H., Yang S.C., Wang Y.S., Chen B.G., Lin C.C., Liu R.H.: Evaluation of various derivatization approaches for gas chromatography–mass spectrometry analysis of buprenorphine and norbuprenorphine. „Journal of Chromatography A”, 2008, 1182, 93-112.

dr hab. Łukasz Haliński
Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański

Czytaj także: Chromatografia jonowa i techniki pokrewne – wczoraj, dziś i jutro