Bakterie lubiące zimno i chłód – jak je izolować, hodować i identyfikować

Z pomocą w identyfikacji przychodzi metagenomika, której to techniki pozwalają na pominięcie etapu hodowli bakterii. Dzięki bezpośredniemu klonowaniu, następnie sekwencjonowaniu i poddaniu analizie materiału genetycznego wyizolowanego bezpośrednio ze środowiska, znacząco wzrasta możliwość poznania drobnoustrojów o specyficznych wymaganiach odżywczych oraz tych, których wobec stanu dzisiejszej wiedzy nie udaje się hodować. Większość drobnoustrojów lodowców, a więc potencjalnych psychrofili, jest trudna lub niemożliwa w hodowli, dlatego stosuje się techniki niezależne od hodowli, by poznać ich metagenom [29]. Oprócz określenia składu taksonomicznego możliwe jest poznanie udziału wszystkich genów oraz profili metabolicznych [30].

Dlatego też do określenia przynależności gatunkowej wyizolowanych mikroorganizmów psychrofilnych najbardziej popularną techniką jest wyizolowanie informacji genetycznej oraz jej amplifikacja w łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) [31]. Metoda ta jest bardzo czuła, lecz wynik w dużym stopniu zależy również od sposobu hodowli materiału, degradacji komórek czy samej ilości materiału genetycznego. W przypadku metody PCR czy w metodach opartych na tej reakcji problemem może okazać się niedostateczna znajomość fizjologii wzrostu unikatowego materiału. Z powodu modyfikacji, jakie posiadają drobnoustroje ekstremofilne, w tym psychrofile, izolacja materiału genetycznego może być mniej wydajna, dlatego najskuteczniejsze są klonowanie do wektora plazmidowego i transformacja do modelowego organizmu, np. E. coli [32]. Do przeprowadzenia reakcji PCR najkorzystniej jest wyizolować materiał genetyczny ze świeżych hodowli w fazie wzrostu logarytmicznego, co w przypadku nieznanych gatunków wolno namnażających się bakterii z ekstremalnego środowiska, często wykazujących słaby wzrost na podłożach, może okazać się problematyczne. Ważny jest też odpowiedni dobór starterów do reakcji. Rekomendowane startery do przeprowadzenia reakcji wykazują dużą skuteczność i powtarzalność, lecz powszechnie stosowane startery mogą nie łączyć się z materiałem genetycznym odmiennych, rzadko występujących bakterii środowiskowych [33]. Aby zidentyfikować bakterie, można użyć wyizolowanego DNA, do sekwencjonowania wykorzystując enzymy restrykcyjne. Tak otrzymane fragmenty poddaje się rozdziałowi poprzez elektroforezę w żelu agarozowym. Poprzez hybrydyzację z sondą o określonym łańcuchu DNA powstają prążki charakterystyczne dla danego gatunku. Metodą opartą na reakcji PCR jest analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restriction fragment length polymorphism, RFLP), wykorzystuje się ją, aby rozpoznać miejsce rearanżacji w genomie oraz mutacji mogących wpłynąć na miejsca restrykcyjne rozpoznawane przez endonukleazy trawiące DNA. Zmiana chociażby jednego nukleotydu w rozpoznawanej przez enzym sekwencji uniemożliwia rozpoznanie miejsca restrykcyjnego oraz rozcięcia DNA. Oczyszczone DNA poddaje się działaniu enzymów restrykcyjnych, po czym dokonuje się wizualizacji wyników za pomocą elektroforezy agarozowej, a następnie przenosi się na filtr nitrocelulozowy lub membranę nylonową techniką southern blot [34]. Hybrydyzacja za pomocą specjalnej, znakowanej sondy, np. biotyną, pozwala na późniejszą wizualizację intersujących fragmentów. Uzyskane wzory są porównywane, a ich podobieństwo jest miarą pokrewieństwa. Metoda umożliwia różnicowanie szczepów poszczególnych gatunków. Do różnicowania szczepów blisko spokrewnionych pomocne jest porównanie losowych wzorców amplifikowanego polimorficznego DNA – RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA). Do amplifikacji używa się tutaj jednego losowego stateru oligonukleotydowego, po czym początkowe cykle reakcji przeprowadza się w niskiej temperaturze, przez co startery nie mają 100-proc. homologii z miejscami wiązania. Kolejne cykle przeprowadza się już w temperaturze dedykowanej dla danego startera. Po rozdzieleniu na żelu, charakterystyczny układ prążków pozwala na rozróżnienie szczepów [35].

Pomocna może być również klasyczna metoda oparta na oznaczaniu guaniny i cytozyny (G+C), gdzie to zmienność zawartości G+C nie powinna być większa niż 5% w obrębie gatunku, a 10% w obrębie rodzaju [28].

Powszechną metodą do identyfikacji bakterii czy to klinicznych, czy środowiskowych, a zwłaszcza przydatną w analizie drobnoustrojów środowisk ekstremalnych, jest sekwencjonowanie genów 16S rRNA [36]. Gen, który koduje 16S rRNA, występuje u wszystkich prokariotów. Wraz z dystansem filogenetycznym między badanymi organizmami rośnie jego stopień zróżnicowania [37]. Możliwa jest dzięki nim identyfikacja bakterii, których nie udało się sklasyfikować metodami biochemicznymi [38]. Postępy w tej dziedzinie również uzyskano dzięki reakcji PCR. Porównanie sekwencji podjednostki 16S rRNA blisko spokrewnionych gatunków ukazuje, że oprócz regionów konserwatywnych analizie należy poddawać fragmenty zmienne dla rozróżnienia gatunków blisko spokrewnionych. Poprzez porównanie do szczepów referencyjnych uzyskanych sekwencji fragmentów 16S rRNA, badane mikroorganizmy mogą zostać sklasyfikowane. Metoda ta jest często stosowana w celu identyfikacji drobnoustrojów z zimnych środowisk [39, 40]. Dużą zaletą tej metody jest możliwość wyodrębniania nowych gatunków bakterii psychrofilnych, kiedy to identyfikacja możliwa jest jedynie do poziomu rodzaju.

Do identyfikacji wykorzystuje się nie tylko materiał genetyczny, ale również występujące w komórkach mikroorganizmów białka. Jedną z takich technik, wykazującą wysoki poziom efektywności, jest spektometria mas MALDI – TOF MS. Metoda ta jest cennym narzędziem identyfikacji za pomocą analizy profili białkowych drobnoustrojów, które stanowią unikatowy „molekularny odcisk palca” bakterii (ang. fingerprint) [41]. Metoda ta wykazuje dużą niezawodność w identyfikacji szczepów klinicznych czy izolowanych od zwierząt, pozwalając na bardzo szybką analizę, znacząco skracając czas identyfikacji [42]. Niestety metoda wykazuje mniejszy odsetek udanych identyfikacji w przypadku bakterii środowiskowych i nie jest jeszcze wystarczająca do identyfikacji mikroorganizmów ekstremalnych środowisk [43]. Spowodowane jest to tym, że otrzymane widma muszą być porównane z widmami referencyjnymi w bazach danych. Białkowe bazy danych nie są jeszcze tak rozwinięte jak te używane przy analizie materiału genetycznego, dlatego też analizując bakterie psychrofilne, na obecnym etapie identyfikacja może okazać się niemożliwa, pomimo otrzymania widma wysokiej jakości, co podkreśla konieczność ciągłego rozwijania baz danych.

Piśmiennictwo

1. Van den Burg B.: Extremophiles as a source for novel enzymes. „Curr. Opin. Microbiol.”, 2003, 6, 3, 213-218.
2. Satyanarayana T., Raghukumar C., Shivaji S.: Extremophilic microbes: Diversity and perspectives. „Curr. Sci.”, 2005, 89, 1, 78-90.
3. Gilichinsky D.A., Wagener S., Vishnevetskaya T.A.: Permafrost microbiology. „Permafr. Periglac. Process.”, 1995, 6, 4, 281-291.
4. Russell N.J. i in.: Cold adaptation of microorganisms. „Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci.”, 1990, 326, 1237, 595-611.
5. Hoyoux A. i in.: Extreme catalysts from low-temperature environments. „J. Biosci. Bioeng.”, 2004, 98, 5, 317-330.
6. Geiges O.: Microbial processes in frozen food. „Adv. Space Res.”, 1996, 18, 12, 109–118.
7. Turkiewicz M.: Drobnoustroje psychrofilne i ich biotechnologiczny potencjał. „Kosmos”, 2006, 4, 55, 307-320.
8. Morita R.Y.: Psychrophilic bacteria. „Bacteriol. Rev.”, 1975, 39, 2, 144-167.
9. Gounot A.M.: Psychrophilic and psychrotrophic microorganisms. „Experientia”, 1986, 42, 11, 1192-1197.
10. Kaufman A., Turkiewicz M.: Białka szoku zimna mikroorganizmów. „Postępy Biochemii”, 2014, 1, 50.
11. Moyer C.L., Morita R.Y.: Psychrophiles and Psychrotrophs. „Encyclopedia of Life Sciences”, 2007.
12. Deming J.W.: Psychrophiles and polar regions. „Curr. Opin. Microbiol.”,2001, 5, 3, 301-309.
13. Beales N.: Adaptation of Microorganisms to Cold Temperatures, Weak Acid Preservatives, Low pH, and Osmotic Stress: A Review. „Compr. Rev. Food Sci. Food Saf.”, 2004, 3, 1, 1-20.
14. D’Amico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C.: Psychrophilic microorganisms: challenges for life. „EMBO Rep.”, 2006, 7, 4, 385-389.
15. Kochan Z., Karbowska J., Babicz-Zielińska E.: Trans-kwasy tłuszczowe w diecie – rola w rozwoju zespołu metabolicznego. „Phmd”, 2010, 64.
16. Russell N.J., Evans R.I., ter Steeg P.F., Hellemons J., Verheul A., Abee T.: Membranes as a target for stress adaptation. „Int. J. Food Microbiol.”, 1995, 28, 2, 255-261.
17. Russell N.J.: Mechanisms of thermal adaptation in bacteria: blueprints for survival. „Trends Biochem. Sci.”, 1984, 9, 3, 108-112.
18. Chintalapati S., Kiran M.D., Shivaji S.: Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation. „Cell. Mol. Biol. Noisy – Gd. Fr.”, 2004, 50, 5, 631-642.
19. Ray M.K. i in.: Adaptation to low temperature and regulation of gene expression in antarctic psychrotrophic bacteria. „J. Biosci.”, 1998, 23, 4, 423-435.
20. D’Amico S., Marx J.C., Gerday C., Feller G.: Activity-Stability Relationships in Extremophilic Enzymes. „J. Biol. Chem.”, 2003, 278, 10, 7891-7896.
21. Whyte L.G., Inniss W.E.: Cold shock proteins and cold acclimation proteins in a psychrotrophic bacterium. „Can. J. Microbiol.”, 1992, 38, 12, 1281-1285.
22. Kawahara H.: The structures and functions of ice crystal-controlling proteins from bacteria. „J. Biosci. Bioeng.”, 2002, 94, 6, 492-496.
23. Sear R.P.: Nucleation: theory and applications to protein solutions and colloidal suspensions. „J. Phys. Condens. Matter”, 2007, 19, 3.
24. Jia Z., Davies P. L.: Antifreeze proteins: an unusual receptor-ligand interaction. „Trends Biochem. Sci.”, 2002, 27, 2, 101-106.
25. Bowman J.P., Mccammon S.A., Brown M.V., Nichols D.S., Mcmeekin T.A.: Diversity and Association of Psychrophilic Bacteria in Antarctic Sea Ice. „APPL Env. MICROBIOL”, 1997, 63, 11.
26. Breezee J. , Cady N., Staley J.T.: Subfreezing Growth of the Sea Ice Bacterium Psychromonas ingrahamii. „Microb. Ecol.”, 2004, 47, 3, 300-304.
27. Bowman J. P.: Methods for psychrophilic bacteria. [In:] Paul J.H. (ed.): Methods in Microbiology. 2001, 30, 591-614.
28. Busse H.J., Denner E.B.M., Lubitz W.: Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics. „J. Biotechnol.”, 1996, 47, 1, 3-38.
29. Choudhari S. i in.: Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota Collected from Byron Glacier, Alaska. „Genome Announc.”, 2013, 1, 2.
30. Simon C., Wiezer A. , Strittmatter A.W., Daniel R.: Phylogenetic Diversity and Metabolic Potential Revealed in a Glacier Ice Metagenome. „Appl. Environ. Microbiol.”, 2009, 75, 23, 7519-7526.
31. Raszka A., Ziembińska A., Wiechetek A.: Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowiskowej. „Czas. Tech. Śr.”, 2009, 106, 101-114.
32. Adamus-Białek W., Wawszczak M.: Zastosowanie sekwencji 16S rRNA w identyfikacji bakteryjnego DNA izolowanego z różnych materiałów. „Rocznik Świętokrzyski”, 2014.
33. Marchesi J.R. i in.: Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA. „Appl. Environ. Microbiol.”, 1998, 64, 2, 795-799.
34. Southern E.M.: Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. „J. Mol. Biol.”, 1975, 98, 3, 503-517.
35. Sadiq F.A., Li Y., Liu T., Flint S., Zhang G., He G.: A RAPD based study revealing a previously unreported wide range of mesophilic and thermophilic spore formers associated with milk powders in China. „Int. J. Food Microbiol.”, 2016, 217, 200-208.
36. Bosshard P.P., Zbinden R., Abels S., Böddinghaus B., Altwegg M., Böttger E.C.: 16S rRNA Gene Sequencing versus the API 20 NE System and the VITEK 2 ID-GNB Card for Identification of Nonfermenting Gram-Negative Bacteria in the Clinical Laboratory. „J. Clin. Microbiol.”, 2006, 44, 4, 1359-1366.
37. Clarridge J.E.: Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. „Clin. Microbiol. Rev.”, 2004, 17, 4, 840-862.
38. Drancourt M., Bollet C., Carlioz A., Martelin R., Gayral J.P., Raoult D.: 16S Ribosomal DNA Sequence Analysis of a Large Collection of Environmental and Clinical Unidentifiable Bacterial Isolates. „J. Clin. Microbiol.”, 2000, 38, 10, 3623–3630.
39. Christner B.C., Kvitko B.H., Reeve J.N.: Molecular identification of Bacteria and Eukarya inhabiting an Antarctic cryoconite hole. „Extremophiles”, 2003, 7, 3, 177-183.
40. Margesin R.: Pedobacter cryoconitis sp. nov., a facultative psychrophile from alpine glacier cryoconite. „Int. J. Syst. Evol. Microbiol.”, 2003, 53, 5, 1291-1296.
41. Fagerquist C.K.: Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. „Expert Rev. Proteomics”, 2017, 14, 1, 97-107.
42. Seng P. i in.: Ongoing Revolution in Bacteriology: Routine Identification of Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. „Clin. Infect. Dis.”, 2009, 49, 4, 543-551.
43. Suzuki Y., Niina K., Matsuwaki T., Nukazawa K., Iguchi A.: Bacterial flora analysis of coliforms in sewage, river water, and ground water using MALDI-TOF mass spectrometry. „J. Environ. Sci. Health Part A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng.”, 2018, 53, 2, 160-173.

Ewa Carolak
Bartłomiej Dudek
Zakład Mikrobiologii, Instytut Genetyki i Mikrobiologii, Uniwersytet Wrocławski

Czytaj także: Rola błonowego białka TolC w biologii bakterii