Analiza na najwyższym poziomie: nowoczesna chromatografia cieczowa w badaniach i przemyśle

W proteomice chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (RPLC) jest najczęściej stosowaną metodą rozdzielania peptydów po enzymatycznym trawieniu białek. Połączenie LC z MS pozwala na identyfikację i ilościową analizę białek, co jest niezbędne w badaniach mechanizmów chorób, poszukiwaniu biomarkerów, analizie modyfikacji potranslacyjnych czy badaniach autentyczności żywności [6]. W metabolomice chromatografia cieczowa umożliwia analizę małocząsteczkowych metabolitów o szerokim spektrum polarności i struktury. Różne techniki separacji, w tym HILIC czy chromatografia jonowymienna, pozwalają na efektywne rozdzielenie metabolitów przed detekcją MS, co jest kluczowe dla profilowania metabolicznego i poszukiwania markerów chorobowych [7]. Połączenie chromatografii cieczowej z MS jest również kluczowe dla lipidomiki, gdzie różnorodność lipidów wymaga wysokiej rozdzielczości, oraz dla badań epigenetycznych i transkryptomicznych, gdzie LCMS wspiera analizę modyfikacji chemicznych oraz metabolitów [8].

7. Chromatografia chiralna

Technika HPLC zawsze odgrywała kluczową rolę w rozdzielaniu związków chiralnych, umożliwiając rozdzielenie enancjomerów różniących się konfiguracją przestrzenną, lecz wykazujących odmienne właściwości biologiczne i farmakologiczne. Rozdzielanie związków chiralnych realizowane jest obecnie najczęściej z wykorzystaniem specjalnych chiralnych faz stacjonarnych, takich jak pochodne polisacharydów (np. celulozy i amylozy), antybiotyki makrocykliczne czy fazy białkowe. Chromatografia chiralna jest stosowana m.in. w kontroli czystości enancjomerycznej substancji czynnych, takich jak ibuprofen, omeprazol czy propranolol, a także w badaniach metabolizmu leków [9].

8. Zastosowanie chromatografii cieczowej do określania rozkładu masy cząsteczkowej

Chromatografia cieczowa jest powszechnie wykorzystywana do rozdzielania związków makrocząsteczkowych, takich jak polimery, w zależności od ich wielkości i masy cząsteczkowej. W tym celu stosuje się głównie chromatografię wykluczania (SEC), znaną również jako chromatografię żelową (GPC). Mechanizm rozdzielania opiera się na różnicach w dostępie cząsteczek do porów fazy stacjonarnej – większe makrocząsteczki eluują szybciej niż mniejsze – to znany mechanizm sita molekularnego. Takie podejście umożliwia określanie rozkładu mas cząsteczkowych, na przykład polimerów, takich jak polistyreny, polietery czy biopolimery, i stanowi obecnie ważne narzędzie w charakterystyce strukturalnej i jakościowej materiałów polimerowych. Bywa także wykorzystywane w procesie przygotowania próbki, umożliwiając np. wyodrębnienie frakcji zawierającej WWA, pestycydy czy sole metali ciężkich z frakcji lipidów lub kwasów humusowych itp.

9. Chromatografia preparatywna

Chromatografię cieczową łatwo jest skalować od poziomu analitycznego do półtechnicznego. Mamy wówczas do czynienia z chromatografią preparatywną LC, która jest stosowana głównie do izolacji, oczyszczania i frakcjonowania związków chemicznych w ilościach od miligramów do gramów [10]. Wykorzystuje się ją m.in. w farmacji do oczyszczania substancji czynnych (API) i metabolitów, w chemii organicznej do izolacji produktów syntez, a także w biotechnologii do rozdzielania peptydów, białek i innych biomolekuł czy w przemyśle spożywczym do izolacji naturalnych barwników, zapachów i składników bioaktywnych z ekstraktów roślinnych. Metoda ta pozwala uzyskać związki o wysokiej czystości, zachowując ich aktywność biologiczną.

Nowoczesne kierunki rozwoju chromatografii cieczowej

Postęp w technologii chromatografii cieczowej obejmuje rozwój ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) oraz jej integrację z zaawansowanymi technikami detekcji, w szczególności z wysokorozdzielczą spektrometrią mas. Połączenie to umożliwia uzyskiwanie wyników o znacznie wyższej rozdzielczości i czułości analitycznej. Zwiększanie rozdzielczości osiąga się również, stosując dwuwymiarową chromatografię cieczową [11].

Jednym z kluczowych kierunków rozwoju techniki HPLC jest miniaturyzacja [12]. Polega ona na zmniejszaniu wymiarów kolumn chromatograficznych (średnicy wewnętrznej i długości) oraz średnicy cząstek fazy stacjonarnej. Skutkuje to skróceniem czasu analizy, obniżeniem natężenia przepływu fazy ruchomej oraz redukcją zużycia rozpuszczalników i ilości próbki, co przekłada się na niższe koszty eksploatacyjne i zgodność z zasadami zielonej chemii. Zastosowanie bardzo drobnych ziaren wypełnienia prowadzi jednocześnie do zwiększenia efektywności rozdzielania, a także do poprawy rozdzielczości i czułości oznaczeń.

Współczesne detektory stosowane w HPLC umożliwiają nie tylko rejestrację intensywności sygnału, lecz także identyfikację związków na podstawie charakterystycznych widm. Automatyzacja analiz oraz rozwój nowych materiałów wykorzystywanych jako fazy stacjonarne znacząco poszerzają zakres zastosowań chromatografii cieczowej, w tym w analizach o charakterze omicznym. Sprzężenie technik LC-MS z narzędziami bioinformatycznymi oraz algorytmami uczenia maszynowego pozwala na kompleksowe przetwarzanie i interpretację wielowymiarowych danych analitycznych [13].

Sztuczna inteligencja (AI) znajduje coraz szersze zastosowanie w chromatografii cieczowej, wspierając zarówno opracowywanie metod analitycznych, jak i analizę uzyskanych danych. Algorytmy uczenia maszynowego wykorzystywane są m.in. do optymalizacji warunków rozdzielania, automatycznego rozpoznawania i dekonwolucji pików, identyfikacji związków w układach LC-MS oraz monitorowania stabilności systemu i sprawności kolumn chromatograficznych. Zastosowanie AI może przyczyniać się do skrócenia czasu analizy, zwiększenia powtarzalności wyników oraz ograniczenia zużycia rozpuszczalników, wpisując się w rozwój zautomatyzowanej i zrównoważonej chromatografii cieczowej. Sztuczna inteligencja nie zastępuje analityka, lecz stanowi zaawansowane narzędzie wspomagające jego pracę.

Co dalej, chromatografio cieczowa?

Wysokosprawna chromatografia cieczowa pozostaje techniką dynamicznie rozwijającą się, której możliwości analityczne wciąż się poszerzają. Granice czułości, liczby jednocześnie oznaczanych analitów oraz czasu analizy są systematycznie przesuwane, a stężenia jeszcze niedawno uznawane za nieosiągalne stopniowo stają się dostępne w rutynowej praktyce laboratoryjnej. Postęp w konstrukcji aparatury, materiałach kolumnowych, detekcji oraz analizie danych sprawia, że technika uznawana kiedyś za eksperymentalną obecna jest dzisiaj w laboratoriach kontroli jakości, klinicznych czy monitoringowych. Wszystko to wskazuje, że przyszłość chromatografii cieczowej wciąż jest przed nami, a wiele jej zastosowań dopiero czeka na odkrycie.

Piśmiennictwo

1. Ganorkar S.B., Shirkhedkar A.A.: Design of experiments in liquid chromatography (HPLC) analysis of pharmaceuticals: analytics, applications, implications and future prospects. „Reviews in Analytical Chemistry”, 2017, 36 (3).
2. Buszewski B., Baranowska I.: Handbook of Bioanalytics. Springer 2022.
3. Di Stefano V., Avellone G., Bongiorno D. et al.: Applications of liquid chromatography–mass spectrometry for food analysis. „Journal of Chromatography A”, 2012, 1259, 74-85,
4. Liu Y., Zhang Z., Lin Y., Zhang J., Zheng C.: Current trends of on-site analytical methods for organic contaminant determination in environmental waters. „TrAC Trends in Analytical Chemistry”, 2026, 194, Part B.
5. Treder N., Pawliszyn J.: ATP, ADP and AMP profiling for diagnostic applications: Recent advances in analytical strategies. „TrAC Trends in Analytical Chemistry”, 2026, 194, Part B.
6. Varunjikar M.S., Lie K.K., Lundebye A.K. et al.: Rasinger, Proteomics for food and feed authentication in the circular food chain. „Trends in Food Science & Technology”, 2024, 153.
7. Sivanesan I., Kannan E.P., Venkatachalam P., Tessini Ortiz C., Gopal J., Muthu M.: Contemporary review on metabolomic applications towards biomarker discovery and tuberculosis diagnosis. „TrAC Trends in Analytical Chemistry”, 2026, 194, Part A. 
8. Bakhytkyzy I., Hewelt-Belka W., Kot-Wasik A.: A comprehensive lipidomic analysis of oilseeds using LC-Q-TOF-MS and dispersive micro-solid phase (D-μ-SPE) extraction techniques. „Journal of Food Composition and Analysis”, 2023, 116. 
9. Ali I., Messali M., Gogolashvili A., Sekkoum K.: Chiral Chromatography and Artificial Intelligence Integration in Enantiomers Separation. „Chirality”, 2025, 37 (12), e70066.
10. Balčiūnas S., Damonskis M., Tamošiūnas V. et al.: Scale-up of analytical IP-RP-HPLC methods for high-purity semi-preparative purification of oligonucleotides. „Journal of Chromatography B”, 2025, 1262.
11. Foster S.W., Parker D., Kurre S., Boughton J. et al.: A review of two-dimensional liquid chromatography approaches using parallel column arrays in the second dimension. „Analytica Chimica Acta”, 2022, 1228.
12. Cortés-Bautista S., Molins-Legua C., Campíns-Falcó P.: Miniaturized liquid chromatography in environmental analysis. A review. „Journal of Chromatography A”, 2024, 1730.
13. Li Y., Fan J., Cheng X. et al.: New revolution for quality control of TCM in industry 4.0: Focus on artificial intelligence and bioinformatics. „TrAC Trends in Analytical Chemistry”, 2024, 181, Part B.

prof. dr hab. inż. Agata Kot-Wasik
Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska

Czytaj także: Chromatografia jonowa i techniki pokrewne – wczoraj, dziś i jutro